過敏性哮喘患者外周血單個核細胞miR-138表達及與Th1/Th2平衡的關系

劉燕 李淑杰 羅云

過敏性哮喘(allergic asthma，AAS)是以氣道高反應性為特征的可逆性氣道阻塞性疾病，主要由肥大細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞等多種細胞參與的慢性氣道炎癥，臨床表現(xiàn)主要為喘息、氣促、胸悶和久咳[1]。我國AAS發(fā)病率約為1.8%，呈持續(xù)增長趨勢[2]。有研究表明，AAS發(fā)病機制與復雜的環(huán)境因素和多種遺傳位點相互作用存在關聯(lián)，迄今為止仍未找到滿意治療方法[3]。另研究發(fā)現(xiàn)miRANs在AAS發(fā)生和治療中起關鍵作用[4]。另外T輔助細胞1(T helper cell type 1，Th1)/T輔助細胞2(T helper cell type 2，Th2)細胞亞群表達與失衡處于哮喘發(fā)病機制研究的中心位置[5]。但AAS患者中miR-138與Th1/Th2平衡的關系目前尚未見報道。因此本研究通過探究AAS患者外周血單個核細胞miR-138表達及其與Th1/Th2平衡的關系，旨在揭示AAS病理過程提供一定參考。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2017年2月至2019年4月收治的AAS患者106例作為AAS組，其中男62例，女44例;年齡26～47歲，平均年齡(37.54±8.21)歲；另選取本院同期健康體檢者100例作為對照組，其中男58例，女42例;年齡25～48歲，平均年齡(38.71±8.69)歲。2組受試者性別比、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準通過，所有受試者對本研究知情并自愿簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①AAS組患者符合《中國支氣管哮喘防治指南》診斷標準[6]并經(jīng)高年資醫(yī)生確診為哮喘患者；②過敏性哮喘為有明確的過敏史或皮試試驗、血清過敏原特異性抗體對1項以上常見吸入性過敏原呈陽性；③患者入組前未應用糖皮質(zhì)素或其他免疫抑制劑。

1.2.2 排除標準：①合并慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張、肺結(jié)核等肺部疾?。虎?1周內(nèi)有急性感染史者；③合并類風濕、糖尿病等慢性??；④患有心、腦、肺等基礎器官疾病者。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集:入組時分別取2組受試者空腹靜脈外周血5 ml，置于含抗凝劑的離心管中，取部分抗凝血，用人單個核細胞分離液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn))分離外周血單個核細胞備用，具體實驗操作嚴格按照說明書進行。另一部分抗凝血用于Th1/Th2相關檢測。

1.3.2 外周血單個核細胞miR-138、T-bet、GATA3表達水平檢測:采用Trizol Reagent試劑盒(購于美國 Invitrogen公司)提取外周血單個核細胞總RNA，提取后采用瓊脂糖電泳方法檢測RNA的完整性。嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國Promega公司)操作說明將2 μl 完整無降解RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參考SYBR Green RCR master mix試劑盒(購自大連寶生物公司)說明書加配反應體系，每個樣本設置3個重復。反應體系加配完成后以ABI 7300 Real-time PCR System 完成。反應條件：96℃ 4 min，預變性，然后三步法反應：94℃ 30 s， 58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)，反應結(jié)束后收集全部實驗數(shù)據(jù)。miR-138以U6為內(nèi)參基因，T-bet、GATA3以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt相對定量的方法計算2組受試者外周血單個核細胞中miR-138、T-bet、GATA3的相對表達量。所用引物序列由下表可見。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 2組受試者外周血單個核細胞Th1/Th2比值及血清相關細胞因子水平檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent AASay,ELISA)測定2組受試者血清白介素2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)表達水平，檢測試劑盒均購Abcam公司，多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司，試驗操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。Th1/Th2比值采用Attune NxT流式細胞儀(美國ThermoFisher Scientific公司)檢測：肝素抗凝外周血加入PMA、IS和BFA，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。加入CD3CD8抗體孵育15 min，裂解，破膜，加入INF-γ-FITC、IL-4-PE抗體分別標記細胞，孵育20 min，洗滌后上機檢測。本研究所有樣品的檢測均由檢驗科同一批人員在同臺儀器上操作，每個樣本重復3次，以3次檢測平均值記為最終實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者外周血單個核細胞miR-138表達水平分析 AAS組患者外周血單個核細胞miR-138表達水平中(1.73±0.29)，顯著高于對照組的(1.02±0.24)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=19.082,P<0.05)。見圖1。

2.2 2組受試者Th1/Th2比值及相關細胞因子表達水平分析 AAS組患者血清IL-2、IFN-γ含量顯著低于對照組(P<0.05)，IL-4和IL-10顯著高于對照組(P<0.05)；AAS組患者Th1/Th2比值顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

圖1 2組受試者外周血單個核細胞miR-138表達水平分析

表2 2組受試者Th1/Th2比值及相關細胞因子表達水平分析

2.3 2組受試者Th1/Th2相關轉(zhuǎn)錄因子表達水平分析 AAS組患者外周血單個核細胞中轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，AAS組患者轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA顯著高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4 過敏性哮喘患者外周血單個核細胞miR-138表達水平與Th1、Th2相關細胞因子相關性分析 miR-138表達水平與細胞因子IL-2、IFN-γ水平呈負相關(r=-0.566、r=-0.616,P<0.05)，與細胞因子IL-4、IL-10呈正相關(r=0.518、r=0.506,P<0.05)。見圖2。

表3 2組受試者Th1/Th2相關轉(zhuǎn)錄因子表達水平分析

圖2 miR-138表達水平與Th1、Th2相關細胞因子相關性分析

2.5 過敏性哮喘患者外周血單個核細胞miR-138表達水平與Th1、Th2相關轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平相關性分析 Pearson相關性分析結(jié)果顯示miR-138表達水平與Th1相關轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA水平呈負相關(r=-0.497,P<0.05)，與Th2相關轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA水平呈正相關(r=0.653,P<0.05)。見圖3。

2.6 過敏性哮喘患者外周血單個核細胞miR-138表達水平與Th1/Th2比值的相關性 過敏性哮喘患者外周血單個核細胞miR-138表達水平與Th1/Th2比值呈負相關(r=-0.606,P<0.05)。見圖4。

3 討論

AAS是常見的頑固性氣道慢性疾病，氣道炎癥是其最主要的癥狀，氣道中的炎癥可導致氣道重構(gòu)，發(fā)生永久性的損傷，最終導致慢性支氣管炎及肺心病[7,8]。AAS具有發(fā)病率高、危害性大、持續(xù)時間長等特點，及時發(fā)現(xiàn)并干預治療可顯著減輕患者痛苦[1]。AAS發(fā)病受遺傳和環(huán)境等多種因素影響，具體發(fā)病機制尚不清楚。已有研究顯示Th1/Th2失衡在AAS發(fā)病過程中發(fā)揮著關鍵作用[5]，但Th1/Th2平衡與AAS發(fā)病的關鍵靶標基因等生物標志物的相關性研究較少。因此，尋找與AAS患者Th1/Th2平衡相關的生物標志物對揭示AAS發(fā)病機制，為尋找有效的治療策略提供一定參考。

圖3 miR-138表達水平與Th1、Th2相關轉(zhuǎn)錄因子相關性分析

圖4 miR-138表達水平與Th1/Th2比值的相關性分析

miRNAs由RNA聚合酶Ⅱ經(jīng)復雜加工形成的成熟miRNAs，是一類非編碼小片段單鏈RNA，通過形成RNA誘導沉默復合體，干擾靶基因RNA的穩(wěn)定性和翻譯過程，調(diào)控靶基因的表達[9]。研究表明，miRNA在多種類型細胞中控制復雜信號通路，通過調(diào)控免疫反應和炎性反應，在AAS發(fā)生過程中揮發(fā)重要作用[4]。miR-138與免疫反應和腫瘤發(fā)生調(diào)控等多種過程有關，在AAS發(fā)生過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[10]，提示miRNA參與免疫應答反應和AAS發(fā)生過程。miR-138通過調(diào)控Runx3表達在哮喘患者發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[11]。Wei等[10]研究發(fā)現(xiàn)miR-138通過結(jié)合CTLA-4、PD-1參與T淋巴細胞有關的免疫反應過程，提示miR-138與炎癥免疫反應有關。單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，單核細胞是血液中最大的白細胞，是巨噬細胞和樹突狀細胞的前身，參與炎癥免疫等相關過程[12]，研究單個核細胞中miRNAs的表達對AAS病程監(jiān)測有一定意義。本研究結(jié)果顯示AAS組患者外周血單個核細胞miR-138表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，提示miR-138在AAS患者外周血單個核細胞中miR-138高表達，可能參與AAS的發(fā)病過程。

Th1/Th2平衡在研究AAS發(fā)病機制研究過程中處于核心位置[5]。Th1和Th2是兩種不同生物學功能的輔助性T淋巴細胞，Th1細胞主要產(chǎn)生分泌IL-2、IFN-γ等，可促進細胞免疫，Th2細胞主要產(chǎn)生分泌IL-4、IL-10等，主要參與體液免疫[13]。IL-4可促進Th0細胞向Th2細胞分化，使Th1細胞比例相對減少。正常情況下Th1細胞和Th2細胞處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持正常的細胞免疫和體液免疫功能[14]。Th1/Th2失衡，促進AAS的發(fā)病過程[5]。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)Th1、Th2相關細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平可反應Th1/Th2平衡狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示AAS組患者Th1相關細胞因子IL-2、IFN-γ含量顯著低于對照組，Th2相關細胞因子IL-4、IL-10顯著高于對照組，提示AAS患者血清Th2相關細胞因子水平升高，AAS組患者Th1/Th2比值顯著低于對照組，表明AAS患者體內(nèi)Th1/Th2平衡失調(diào)，向體液免疫方向偏移，與Qiu等[11]發(fā)現(xiàn)IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10在哮喘患者血清中含量變化一致，提示Th1、Th2相關細胞因子參與AAS發(fā)病過程。T-bet和GATA3轉(zhuǎn)錄因子分別是Th1、Th2相關轉(zhuǎn)錄因子，T-bet、GATA3表達水平與Th1/Th2平衡顯著相關[15]。本研究結(jié)果顯示AAS組患者外周血單個核細胞中轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA表達水平顯著低于對照組，GATA3 mRNA顯著高于對照組，提示T-bet、GATA3 mRNA表達水平可能與AAS發(fā)病有關。

miRNA通過調(diào)控復雜信號通路，參與疾病發(fā)生、進展等過程，探究miRNA在AAS發(fā)病機制中的作用，對AAS治療有積極意義。本研究結(jié)果顯示miR-138與IL-2、IFN-γ水平呈負相關，與IL-4、IL-10水平呈正相關，提示miR-138高表達可能抑制Th1相關細胞因子表達，促進Th2相關細胞因子表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-138表達水平與Th1相關轉(zhuǎn)錄因子T-bet mRNA水平呈負相關，與Th2相關轉(zhuǎn)錄因子GATA3 mRNA水平呈正相關，進一步揭示miR-138可能通過影響T-bet、GATA3 mRNA水平進而影響Th1、Th2相關因子因子表達。Fu等[16]研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病中miR-138通過RUNX3通路影響IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、T-bet、GATA3等因子影響Th1/Th2平衡。本研究分析發(fā)現(xiàn)miR-138與Th1、Th2細胞亞群比值呈負相關，提示提示AAS患者外周血單個核細胞中miR-138水平與Th1/Th2比值密切相關，可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2影響機體炎癥反應。但miR-138與Th1/Th2相關因子是否存在直接調(diào)控關系尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，AAS患者外周血單個核細胞miR-138表達水平上調(diào)，可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2影響相關細胞因子表達，影響AAS患者機體炎癥狀態(tài)，但miR-138對Th1/Th2平衡的具體調(diào)控機制有待進一步研究。