Axin1、Gsk-3β和CD82在皮膚鱗狀細胞癌中的表達

朝魯門 張士發(fā)

1錦州醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽，110016；2北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院皮膚科，沈陽，110016

皮膚鱗狀細胞癌(cSCC)是起源于表皮或附屬器角質形成細胞的惡性腫瘤。大多數(shù)cSCC發(fā)生在老年患者的光暴露部位，在日光性角化病(actinic keratosis，AK)基礎上發(fā)病。國內研究發(fā)現(xiàn)，cSCC的發(fā)病率約為29.4%，已超過基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)成為發(fā)病率第一位的非黑素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancer，NMSC)[1]。隨著我國人口老齡化的發(fā)展和皮膚惡性腫瘤病理活檢患者的數(shù)量增多，cSCC的確診病例數(shù)亦逐年上升。除紫外線輻射外，其他危險因素還包括慢性免疫抑制狀態(tài)(如人類免疫缺陷病毒感染)、慢性皮膚病、人乳頭瘤病毒感染等。cSCC早期即可發(fā)生轉移，這不僅可增加患者負擔，也對后續(xù)的治療造成巨大挑戰(zhàn)。

然而，cSCC發(fā)生的分子機制尚不完善。有研究表明，Wnt信號通路參與了cSCC的發(fā)生和發(fā)展[2]。Wnt通路在細胞分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，它由一系列信號傳導蛋白組成，成員包括軸抑制蛋白(axis inhibitor factor 1，Axin1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，Gsk-3β)和腺瘤性息肉病腫瘤抑制基因(adenomatous polyposis coli，APC)等。分化簇82(cluster of differentiation 82，CD82)是Tetraspanin糖蛋白超家族的成員，是一種腫瘤轉移抑制基因。最近有研究發(fā)現(xiàn)，CD82可通過下調細胞膜上的Wnt受體來抑制Wnt信號通路。本文研究了Axin1、Gsk-3β和CD82在CSCC中的表達，探討其在CSCC中的作用。

1 資料與方法

1.1 病例資料 實驗組取自2008年1～12月于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院沈河院區(qū)皮膚科就診的40例臨床資料完整的cSCC患者術后組織石蠟塊，對照組取自15例同期于本科室就診的良性皮膚病患者的皮膚組織。根據(jù) Broders[3]分級法將cSCC分為I～IV級，其中I級15例(37.5%),II級15例 (37.5%),III級10例(25%),未見IV級。術前均未進行放、化療，既往史及過敏史無特殊。

1.2 免疫組化步驟 兔抗人Axin1單抗、Gsk-3β單抗、CD82單抗,免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。免疫組化步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用PBS代替一抗作空白對照。

1.3 結果判斷 由兩位病理醫(yī)師在不知臨床資料的情況下對免疫組化結果進行評估，在顯微鏡下，每張切片隨機選擇5個視野，在15×20高倍鏡下觀察計數(shù)100個瘤細胞，鏡下表現(xiàn)為在細胞質內或沿細胞膜呈黃色或棕色顆粒狀沉積視為陽性表達。無陽性細胞計0分，≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。細胞染色與背景無異計0分，染色為淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。免疫組化評分=陽性細胞百分比積分×細胞染色強度積分。免疫組化評分>3分為免疫反應(+)[4]。

1.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，率比較采用卡方檢驗與Fisher確切概率法，相關性分析采用Spearman秩相關分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC及正常皮膚組織中的表達 Axin1、Gsk-3β和CD82陽性信號大部分定位于細胞質內，少數(shù)定位于細胞膜或細胞核。Axin1在cSCC和正常皮膚組織中的陽性表達率分別為42.5%、86.7%，Gsk-3β在cSCC和正常皮膚組織中的陽性表達率分別為40.0%、80.0%，CD82在cSCC和正常皮膚組織中的陽性表達率分別為35.0%、73.3%，Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC中的陽性表達率顯著低于正常皮膚組織，P值分別為0.003、0.008、0.011，差異具有統(tǒng)計學意義。Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC組織的陽性表達率與正常組織相比顯著降低。見表1和圖1。

2.2 Axin1、Gsk-3β和CD82與cSCC患者各病理學特征間的關系 Axin1在cSCC I級、II級、III級的陽性表達率分別為66.7%、40.0%、10.0%，Gsk-3β在cSCC I級、II級、III級的陽性表達率分別為73.3%、20.0%、20.0%，CD82在cSCC I級、II級、III級的陽性表達率分別為60.0%、26.7%、10.0%，Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC中的陽性表達率III級

1a:Axin1主要分布于癌細胞胞質中，少數(shù)表達于胞膜，積分為4；1b:Gsk-3β在腫瘤細胞中染色淺，積分為2；1c：CD82在癌組織中染色淺，表達少，積分為1;1d:Axin1在表皮全層呈強陽性表達，陽性染色主要定位于胞膜，積分為12；1e: Gsk-3β在基底層以上角質形成細胞中廣泛分布，積分為6；1f:CD82在基底層以上角質形成細胞中廣泛分布，積分為6

表2 Axin1、Gsk-3β和CD82與cSCC患者各病理學特征間的關系

2a: Axin1廣泛分布于癌細胞胞質中，積分為9；2b: Axin1分布于癌細胞胞質中，少數(shù)沿細胞膜分布，積分為6；2c:癌細胞散在染色，積分為3；2d: Gsk-3β均勻分布于癌巢，積分為6；2e: Gsk-3β均勻分布于癌巢中，積分為3；2f:腫瘤細胞未染色，積分為0；2g: CD82廣泛表達于癌巢中，積分為6；2h: CD82散在分布于癌巢，積分為2；2i: CD82在腫瘤細胞中散在染色，積分為1

2.3 Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC組織中表達的相關性 Axin1、Gsk-3β在cSCC中呈正相關表達(r=0.677，P<0.05)；Axin1和CD82在cSCC中的表達無相關性(P=0.596)；Gsk-3β和CD82在cSCC中的表達無相關性(P=0.671)。見表3、4、5。

表3 Axin1與Gsk-3β在cSCC組織的相關性

表4 Axin1與CD82在cSCC組織的相關性

表5 Gsk-3β與CD82在cSCC組織的相關性

3 討論

Wnt信號傳導通路是皮膚發(fā)育的基礎，持續(xù)的Wnt信號能阻斷雞胚表皮母細胞對成纖維細胞生長因子(FGFs)的反應，促進骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的表達，誘導新生皮膚上皮中角蛋白的產生，從而形成表皮。相反，若表皮細胞缺乏對Wnt信號的暴露，則促進FGFs信號傳導，形成神經(jīng)系統(tǒng)[5]。

Wnt通路主要通過調節(jié)胞質內的β-catenin發(fā)揮生物學功能。無Wnt信號時，Axin1作為支架蛋白與Gsk-3β和APC結合形成降解復合物，從而降解胞質中的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，使其保持一定的濃度。當Wnt配體通過與細胞膜上的七跨膜受體Frizzled(FZD)和LRP5/6共受體結合激活該通路時，可導致細胞內Dishevelled(DVL)的募集。DVL拮抗降解復合物的活性使β-catenin在細胞質內聚積，然后發(fā)生核轉位，在T細胞因子/淋巴增強因子轉錄因子(TCF/LEF)的作用下，β-catenin引起Wnt靶基因轉錄[6]。此外，被Gsk-3β磷酸化的Axin1能夠增加它自身的穩(wěn)定性，而未被磷酸化的Axin1對β-catenin的親和力較低，因此會降低它促進β-catenin降解復合物形成的能力。研究發(fā)現(xiàn)，CD82可通過多種機制抑制Wnt信號通路。一是可以抑制β-catenin酪氨酸磷酸化，穩(wěn)定細胞膜上的E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)-β-catenin復合物，阻止癌細胞從原發(fā)癌巢中解離，從而限制癌細胞轉移。二是可通過下調FZD來抑制信號傳導。三是通過下調Gsk-3β和激酶酪蛋白激酶1α(CK1α)，抑制β-catenin在Ser45、Ser33、Ser37和Thr41的磷酸化[7]。

Axin1參與細胞生長、增殖、分化、癌變和凋亡等多種調控過程[8]。既往關于鱗癌的國內外研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌[9]、非小細胞肺癌[10]等組織中Axin1的表達降低與不良腫瘤分化、淋巴結轉移等呈負相關。在皮膚病方面，梁俊琴等[11]發(fā)現(xiàn)，Axin1 mRNA在cSCC中的表達低于正常皮膚組織，且其在cSCC中的低表達與病理分級無關。本實驗發(fā)現(xiàn)，Axin1在cSCC中的陽性表達率顯著低于正常皮膚組織，分別為42.5%、86.7%，提示其表達降低可能與cSCC發(fā)病有關，隨著病理分級升高，其表達率逐級降低，這說明表達強度可能與腫瘤進展有關，與既往研究結果基本符合。

Gsk-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究發(fā)現(xiàn)其在糖尿病、阿爾茲海默癥和免疫疾病等的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在皮膚病方面，Ma等[12]發(fā)現(xiàn)Gsk-3β在cSCC中的表達顯著低于鄰近的非腫瘤角質形成細胞,說明Gsk-3β的下調或失活對表皮細胞是致癌的。然而，Ahn等[13]發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌中Gsk-3β的表達高于正常宮頸組織，提示Gsk-3β促進了宮頸鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，Gsk-3β在cSCC中的表達率顯著降低，分別為80.0%、40.0%，這與MA等研究者的結果一致。Gsk-3β在腫瘤中的作用受其磷酸化形式、組織中表達位置和腫瘤類型的影響，在不同腫瘤中可介導完全相反的腫瘤結局。

KAI1/CD82是Dong等[14]發(fā)現(xiàn)的位于染色體11p11.2上的腫瘤轉移抑制基因。CD82可抑制多種腫瘤的轉移，與腫瘤的侵襲和預后密切相關。在多種器官鱗癌(口腔鱗癌[15]、陰莖鱗癌[16]、喉鱗癌[17]和宮頸癌[18])中，均報道了CD82的低表達與腫瘤的發(fā)生有關。另外，在食管鱗癌中CD82的表達與病理分級、遠處轉移和預后不良有關[19]。在皮膚病中，CD82在增生性痣、原發(fā)性黑素瘤和轉移性黑素瘤中的表達逐漸降低[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，CD82在cSCC中的表達率顯著降低，分別為73.3%、35.0%，提示其表達降低可能與cSCC發(fā)病有關，隨著病理分級升高，其表達率逐級降低，這說明表達強度可能與腫瘤進展有關，與以往研究結果一致。

在乳腺癌中，胞漿中Axin保留的表達(≥40%腫瘤細胞呈陽性染色)與Gsk-3β呈正相關[21]。陳靖等[22]研究Axin、Gsk-3β在食管癌中的作用時也發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌中Axin與Gsk-3β的表達呈正相關，從而證實了Axin、Gsk-3β在β-catenin降解復合物中的功能結合，需兩者協(xié)同作用方能有效地將β-catenin磷酸化。

△Np63a上調CD82以抑制細胞侵襲，Gsk-3β可能通過調節(jié)△Np63a-CD82軸來調節(jié)細胞侵襲。CD82是△Np63a(不含N-末端反式激活結構域的P63蛋白亞型)的直接轉錄靶點，后者是在上皮細胞和鱗狀細胞癌中表達的主要異構體?！鱊p63a的表達抑制了Matrigel細胞的生長和癌細胞的侵襲，在很大程度上可被CD82的特異性消融所逆轉。相反，敲除△Np63a基因可增加細胞侵襲，而CD82的異位表達可逆轉這一過程。此外，用藥物或RNA抑制Gsk-3β活性可導致△Np63a和CD82表達下調，細胞侵襲力增加[23]。在cSCC中，未發(fā)現(xiàn)CD82與Wnt負調節(jié)因子Axin1和Gsk-3β表達的相關性，因此，Wnt通路可能不經(jīng)過CD82促進發(fā)病，這可能與組織特異性，且cSCC大多發(fā)生在AK的皮損上有關。

Axin1在cSCC中的低表達提示Axin1在cSCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用，可為cSCC的早期診斷和治療提供參考。Gsk-3β在細胞凋亡、細胞周期、DNA修復、腫瘤生長和癌癥免疫等許多生物學過程中均發(fā)揮作用，因此靶向Gsk-3β將是一種合理的放射、化療和免疫相結合治療癌癥的策略。CD82單抗(CD82-mAb)也被證明在急性髓系白血病(AML)小鼠模型中，可將骨髓中的CD34+白血病細胞轉移到外周血中，且CD82-mAb與阿糖胞苷(AraC)聯(lián)合應用比單獨使用AraC或CD82-mAb治療延長了攜帶人類AML細胞的免疫缺陷小鼠的生存期。

本研究證明Wnt信號通路在cSCC中有促進作用，但詳細的分子信號傳遞過程仍需下一步的實驗進行驗證。本組病例中無淋巴結轉移患者，因此未能研究三種蛋白在轉移的淋巴結或遠隔組織中的表達情況。下一步的實驗需納入晚期患者，檢測β-catenin及下游信號物質，應用Western Blot技術進行定量分析，CCK8實驗檢測細胞增殖和Transwell實驗檢測細胞侵襲。晚期cSCC預后差，因此明確所涉及的分子途徑對于開發(fā)新的治療方法非常重要，本研究也為cSCC的診斷及治療提供部分理論基礎。