龍膽瀉肝湯激活Bax/Caspase-3通路并誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

楊冠群 郭 春 魏海峰 周 煜 周曙杰 梁晨希 吳國(guó)境 許博涵 鄒永新 張曉杰 孫淑娜

1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系，山東濟(jì)南，250012； 2山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南，250355；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，山東濟(jì)南，250011

龍膽瀉肝湯由龍膽草、梔子、黃芩、木通、澤瀉等十味中草藥配制而成[1]，是一種具備清肝利膽，瀉實(shí)火清濕熱之效用的清熱藥劑[2]。近年來(lái),龍膽瀉肝湯已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床皮膚科,并對(duì)銀屑病癥狀的改善有良好的效果[3]，但作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制還未被了解，細(xì)胞和分子水平的作用效果也尚未得到驗(yàn)證。銀屑病患者皮損處的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖是其最顯著的病理特征之一[4]，本研究利用人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞分析了龍膽瀉肝湯對(duì)銀屑病皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響以及機(jī)制，為解釋龍膽瀉肝湯治療銀屑病的臨床作用機(jī)制提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞：武漢大學(xué)保藏中心 (china center for type culture collection， CCTCC)， 資源編號(hào)3142C0001000001712。

1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清：美國(guó)Gibco生命技術(shù)公司；RIPA裂解液，Tunel凋亡染色試劑盒：上海碧云天公司；DAPI：西格瑪公司；Trizol RNA提取裂解液：美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司；Western blot用一抗：美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司；Western blot用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗：北京ZSGB-Gio公司；Western blot ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK：MedChem Express公司；PCR引物：上海Sangon Biotech公司；LightCycler 480 SYBR Green I Master：瑞士ROCHE公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 藥品 龍膽瀉肝湯藥液：龍膽草12 g、山梔18 g、澤瀉24 g、黃芩18 g、柴胡20 g、生地黃40 g、車(chē)前子18 g、當(dāng)歸16 g、甘草12 g。將上述中藥濃縮成2 mL相當(dāng)于3 g原中藥材的藥液，在超凈臺(tái)內(nèi)過(guò)濾除菌，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?xì)胞培養(yǎng)時(shí)稀釋到相應(yīng)終濃度。

1.4 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)、倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)、熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、蛋白垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)生命Bio-Rad產(chǎn)品有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，每24 h換液。取狀態(tài)較好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。藥物組，100 μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；對(duì)照組，含與藥物組藥物等體積去離子水的DMEM培養(yǎng)基同等條件下培養(yǎng)72 h。

2.2 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 等體積不同藥物濃度梯度的DMEM培養(yǎng)基同等條件下培養(yǎng)，設(shè)置藥物濃度梯度為：0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL。參照Tunel染色試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，用含有DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)的抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察。每組細(xì)胞隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡(×200)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算HaCaT細(xì)胞凋亡率。凋亡率=BrdU陽(yáng)性細(xì)胞/100×100%。取3個(gè)視野的平均百分?jǐn)?shù)作為結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2.3 Western blot用RIPA裂解液冰上裂解提取藥物處理組的HaCaT細(xì)胞總蛋白 用BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)；取40 μg樣品變性；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，在含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉(25℃，1 h)，一抗孵育(4℃，12 h)，TBST溶液洗膜三次，5 min/次，二抗孵育(37℃，1 h)，TBST溶液洗膜三次，5 min/次；ECL化學(xué)發(fā)光，顯影定影，膠片曝光，結(jié)果使用掃描儀掃描保存。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR 使用Trizol法裂解藥物處理的HaCaT細(xì)胞提取RNA，并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)體系：每10 μL反應(yīng)體系包括去離子水4.2 μL、cDNA 0.5 μL、逆轉(zhuǎn)錄引物0.3 μL、Light Cycler 480 SYBR Green I Master試劑5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃，3 min；變性95℃，30 s；退火60℃，30 s；延伸72℃，30 s。共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Roche Light Cycler 480自帶分析程序比較不同樣本同一目的基因的表達(dá)變化情況，并進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 22.0(Windows)統(tǒng)計(jì)軟件處理上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)應(yīng)用t檢驗(yàn)分析評(píng)價(jià)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 龍膽瀉肝湯誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡 80 μg/mL龍膽瀉肝湯處理72 h后，在倒置顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組與未使用藥物處理的對(duì)照組相比，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。具體表現(xiàn)為：可見(jiàn)原來(lái)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸脫落，細(xì)胞體積減小、形狀變圓、折光性增強(qiáng)(圖1a)；DAPI染色后在熒光鏡下觀察，明顯可見(jiàn)細(xì)胞顯現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞狀態(tài)(圖1b)，細(xì)胞核裂解為大小不等的凋亡小體。

Tunel染色結(jié)果顯示，龍膽瀉肝湯處理72 h后的HaCaT細(xì)胞與未經(jīng)處理的細(xì)胞凋亡比例相比，實(shí)驗(yàn)組的 HaCaT細(xì)胞Tunel陽(yáng)性染色細(xì)胞比例明顯上調(diào)，并且與龍膽瀉肝湯處理濃度的增加呈正相關(guān)(圖1c)，提示龍膽瀉肝湯誘導(dǎo)凋亡的作用呈劑量依賴性增加。

1a:對(duì)照組和藥物組倒置光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察；1b:熒光顯微鏡下觀察藥物組細(xì)胞凋亡，白色箭頭指示凋亡細(xì)胞；1c:Tunel檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)。標(biāo)尺，50 μm。與對(duì)照組比較，**：P<0.01；***：P<0.001

3.2 龍膽瀉肝湯抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá) 為了明確龍膽瀉肝湯誘導(dǎo)HaCaT凋亡的作用機(jī)制，我們利用western blot分析了兩組HaCaT細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因Bcl-2和Bax表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖2所示：40 μg/mL龍膽瀉肝湯處理72 h后細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下降，同時(shí)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)有明顯上調(diào)(圖2a)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與檢測(cè)到的蛋白水平的變化相一致，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的mRNA也有明顯下降，而B(niǎo)ax的mRNA有明顯上調(diào)(圖2b)。

2a：western blot實(shí)驗(yàn)；2b：實(shí)時(shí)定量PCR *:P<0.05

3.3 龍膽瀉肝湯通過(guò)激活caspase 3依賴的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 caspase-3蛋白的激活在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此我們隨后對(duì)caspase-3的蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示40 μg/mL濃度的龍膽瀉肝湯處理HaCaT細(xì)胞72 h后，無(wú)論是總蛋白水平還是活性caspase-3水平均有明顯的增加。為了進(jìn)一步明確結(jié)論，我們使用caspase-3特異性抑制劑Z-DEVD-FMK(終濃度50 μM)預(yù)處理細(xì)胞2 h后再加入40 μg/mL龍膽瀉肝湯繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞72 h。Tunel染色結(jié)果顯示， Z-DEVD-FMK可有效拯救藥液誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示龍膽瀉肝湯可通過(guò)上調(diào)caspase-3誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡。

4 討論

銀屑病是一類(lèi)臨床上常見(jiàn)的皮膚病[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，銀屑病的全球平均發(fā)病率為2%～3%，在發(fā)達(dá)國(guó)家能達(dá)到4%～6%，而且多數(shù)銀屑病患者年齡在40歲以下[6,7]。銀屑病具有病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，很多患者終生不愈，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，患者不僅遭受著身心的折磨，其家庭乃至整個(gè)社會(huì)也承受著沉重的負(fù)擔(dān)[8]。相比目前常用的免疫抑制療法，傳統(tǒng)的中醫(yī)在銀屑病治療時(shí)在改善病情的同時(shí)，還展現(xiàn)出緩解期長(zhǎng)、不良反應(yīng)小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。龍膽瀉肝湯具備清肝利膽，瀉實(shí)火清濕熱之效用，是中醫(yī)藥領(lǐng)域經(jīng)典的清熱方劑[2]，臨床上主要用于治療肝膽實(shí)火、目赤頭疼、口苦脅痛、耳聾耳腫、陰癢陰腫等癥狀[18]。近年來(lái)，龍膽瀉肝湯在銀屑病治療中也表現(xiàn)出較好的療效[2]，但其作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制尚不清楚，細(xì)胞和分子水平的作用效果也尚未得到驗(yàn)證。

3a: western blot實(shí)驗(yàn);3b: Caspase-3抑制劑逆轉(zhuǎn)Tunel法凋亡實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組比較，**：P<0.01；***：P<0.001

角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)可以通過(guò)發(fā)揮防御病原體、隔離紫外線、防止水分蒸發(fā)等多種重要作用，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。KC增殖分化凋亡發(fā)生異常時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致以銀屑病為代表的多種角化性皮膚病或其他表皮腫瘤。銀屑病皮損處存在明顯的KC增殖分化異常，例如，不完全的KC分化和成熟縮短(角化不全)以及KC增厚(角化過(guò)度)導(dǎo)致表皮的高增殖和棘層的肥厚，這種變化的結(jié)局是KC的異常積聚，形成鱗狀皮屑[7-9]。此外，細(xì)胞因子對(duì)銀屑病病程的發(fā)展也發(fā)揮著不容忽視的作用。皮損處活化T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF、INF-γ、IL-17和IL-22等細(xì)胞因子可以活化KC內(nèi)NF-κB 和STAT3等信號(hào)通路，誘導(dǎo)KC異常增殖分化發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究證明KC也是產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要細(xì)胞[8]，激活的KC又可以產(chǎn)生IL-1b,IL-6、IL-8、TNF-α、CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL5、CCL20、LL37等，趨化多種炎性細(xì)胞，從而使皮損處及皮損周?chē)难装Y反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大，形成一個(gè)惡性循環(huán)[7,8,10]。因此，抑制KC的過(guò)度增生對(duì)臨床治療銀屑病有著重要的實(shí)踐意義。紫外光療，外用維A酸、維生素D類(lèi)似物以及注射水合鈣離子等臨床療法均是通過(guò)抑制KC增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)其治療目的[7]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是治療包括腫瘤在內(nèi)多種細(xì)胞異常增生疾病的有效途徑。在銀屑病治療中，誘導(dǎo)皮損處異常增殖KC凋亡也是緩解銀屑病的有效方法之一[11]，如紫外線光療。Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的兩個(gè)經(jīng)典“開(kāi)關(guān)蛋白”。Bcl-2的激活和表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著促凋亡作用[12,13]。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果告訴我們龍膽瀉肝湯對(duì)人HaCaT細(xì)胞起著明顯的誘導(dǎo)凋亡的作用，而且這種誘導(dǎo)作用伴隨著B(niǎo)cl-2的顯著下調(diào)和Bax的顯著上調(diào)。鑒于Bcl-2和Bax在凋亡中的重要功能，這些結(jié)果提示龍膽瀉肝湯可能通過(guò)調(diào)控Bcl家族成員的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡的誘導(dǎo)。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)最下游的蛋白酶caspase-3是凋亡過(guò)程的關(guān)鍵執(zhí)行因子[14]，尤其當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝結(jié)和DNA裂解時(shí)[15,16]并且有研究證實(shí)Bcl-2和Bax以及caspase-3相互影響，共同調(diào)控細(xì)胞的凋亡進(jìn)程[17]。我們的結(jié)果顯示龍膽瀉肝湯可導(dǎo)致HaCaT細(xì)胞內(nèi)caspase-3激活，而抑制caspase-3的活性能有效逆轉(zhuǎn)龍膽瀉肝湯誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡。因此，龍膽瀉肝湯可通過(guò)激活caspase-3途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)HaCaT細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。然而龍膽瀉肝湯對(duì)Bax和Bcl-2表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制如何？龍膽瀉肝湯是否直接調(diào)控Bax和Bcl-2來(lái)實(shí)現(xiàn)caspase-3的激活？龍膽瀉肝湯是否還有其他的細(xì)胞凋亡調(diào)控靶點(diǎn)？此外，藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用可能通過(guò)細(xì)胞毒性也可以通過(guò)凋亡和壞死等途徑。我們發(fā)現(xiàn)低濃度龍膽瀉肝湯就可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并激活凋亡關(guān)鍵標(biāo)志物活性caspase-3的表達(dá)，提示凋亡途徑在龍膽瀉肝湯抑制HaCaT細(xì)胞增殖中具有重要意義。但同時(shí)，我們只進(jìn)行了Tunel染色和活性caspase-3檢測(cè)，不能排除其他途徑也在該過(guò)程中發(fā)揮作用。針對(duì)這些問(wèn)題還有待于在下一步工作中進(jìn)一步研究。