微量液體培養(yǎng)基最低抑菌濃度法與羅氏比例法在結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中的價(jià)值比較

劉金娜

(遼寧省遼陽(yáng)市衛(wèi)生健康服務(wù)中心 臨床檢驗(yàn)科, 遼寧 遼陽(yáng), 111000)

近年來(lái)，中國(guó)結(jié)核病防治工作取得了明顯進(jìn)展，但仍任重道遠(yuǎn)[1-2]。耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)及廣泛傳播，使得結(jié)核病的治療與控制難度增大[3]。研究[4-5]顯示，目前全球結(jié)核病情控制的最大障礙之一為耐藥結(jié)核菌，該結(jié)核菌傳染期長(zhǎng)，痰菌轉(zhuǎn)陰速度慢，診治過(guò)程較為復(fù)雜，治療費(fèi)用高，且用藥后不良反應(yīng)較多。藥敏試驗(yàn)可更好地評(píng)估結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感性，為臨床制定合理有效的結(jié)核病治療方案提供參考依據(jù)[6-7]。異煙肼、利福平等是一線的抗結(jié)核類(lèi)藥物，快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)此類(lèi)藥物的敏感性尤為重要, WHO推薦使用的羅氏比例法穩(wěn)定性較好，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要4周才能報(bào)告結(jié)果，無(wú)法及時(shí)為結(jié)核病患者的臨床用藥提供有效的參考意見(jiàn)[8-9]。因此，尋找一種靈敏度高、檢測(cè)快速的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)方法，對(duì)于結(jié)核病的臨床治療非常重要。本研究比較了微量液體培養(yǎng)基最低抑菌濃度(MIC)法和羅氏比例法在結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究以100株結(jié)核分枝桿菌菌株(由遼寧省結(jié)核實(shí)驗(yàn)室提供)作為研究樣本，研究時(shí)間為2018年3月—2019年6月，分別采用羅氏比例法與微量液體培養(yǎng)基MIC法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性。

1.2 方法

羅氏比例法: 使用接種環(huán)將新鮮的菌落提取后，置于磨菌瓶中，與麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，制作成1 mg/mL的菌懸液，再經(jīng)過(guò)100倍稀釋?zhuān)玫?0-2mg/mL菌液，之后再稀釋為10-4mg/mL, 獲取2種濃度的工作菌液，分別在2種工作菌液中接種(使用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán))至含藥培養(yǎng)基的斜面。各種抗結(jié)核藥物在培養(yǎng)基中的濃度見(jiàn)表1。

微量液體培養(yǎng)基MIC法: 將羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4周的結(jié)核分枝桿菌挑取出來(lái)，用含5%吐溫80的生理鹽水將其溶解、稀釋?zhuān)倥c標(biāo)準(zhǔn)的麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行對(duì)比，制成1 mg/mL的菌懸液，再吸取制備好的混懸液0.2 mL, 將其添加于1瓶培養(yǎng)液中，充分搖勻后作為工作菌液; 用無(wú)菌吸管吸取工作液至各個(gè)孔板中，各0.5 mL。將瓶蓋蓋好，并將藥敏板置于自封袋中，在37 ℃環(huán)境中孵育, 6 d后觀察質(zhì)控孔，如果出現(xiàn)白色顆粒沉淀，在孔中添加25 μL顯色劑B、12 μL顯色劑A，在37 ℃環(huán)境中孵育1～2 d。各種抗結(jié)核藥物在藥敏板中的濃度情況見(jiàn)表1。

表1 各種抗結(jié)核藥物在培養(yǎng)基或藥敏板中的濃度 μg/mL

1.3 觀察指標(biāo)

采用微量液體培養(yǎng)基MIC法和羅氏比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇、二卡那霉素、異煙肼、利福平、氧氟沙星、卷曲霉素的敏感性，比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果。羅氏比例法結(jié)果判定[10-11]: 在36 ℃環(huán)境孵育4周后，若耐藥性檢測(cè)結(jié)果超過(guò)1%, 則為耐藥，若高稀釋度空白對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)低于20個(gè)，則應(yīng)該重復(fù)試驗(yàn); 微量液體培養(yǎng)基MIC法結(jié)果判定: 在36 ℃孵育6 d后，將顯色劑加入其中，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d后，若質(zhì)控孔顯示紅色，則將其他藥敏孔與質(zhì)控孔進(jìn)行對(duì)比，若為藍(lán)色則表示敏感，若為紅色則為耐藥，若質(zhì)控孔顯示藍(lán)色，而藥敏孔顯示紅色，則需要重復(fù)試驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究將微量液體培養(yǎng)基MIC法與羅氏比例法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中, 2種檢測(cè)方法結(jié)果的一致性判斷采用Kappa檢驗(yàn)。Kappa值超過(guò)0.75，表示2種檢測(cè)方法一致性良好;Kappa值為0.40～0.75，表示2種檢測(cè)方法一致性一般;Kappa值低于0.40，表示2種檢測(cè)方法一致性欠佳。

2 結(jié) 果

2.1 2種方法的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較

微量液體培養(yǎng)基MIC法與羅氏比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇、二卡那霉素、利福平、異煙肼、氧氟沙星、卷曲霉素藥物的敏感性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表2。

表2 2種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)不同藥物的敏感性結(jié)果比較[n(%)]

2.2 2種檢測(cè)方法的一致性判斷

將羅氏比例法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，評(píng)估微量液體培養(yǎng)基MIC法的診斷效能。微量液體培養(yǎng)基MIC法在乙胺西醇、二卡那霉素、利福平、異煙肼、氧氟沙星、卷曲霉素藥敏試驗(yàn)中的敏感度與特異度較高，與羅氏比例法具有良好的一致性。見(jiàn)表3。

表3 微量液體培養(yǎng)基MIC法的診斷效能

3 討 論

隨著抗結(jié)核藥物的大量使用，結(jié)核耐藥菌株在臨床出現(xiàn)并播散，耐藥結(jié)核病已經(jīng)逐漸成為結(jié)核病防治工作中的重點(diǎn)及難點(diǎn)[12-13]。相關(guān)研究[14]顯示，目前全球結(jié)核感染情況嚴(yán)重，約1/3的人感染了結(jié)核菌，且發(fā)展中國(guó)家每年新發(fā)800萬(wàn)～1 000萬(wàn)患者。在中國(guó)，每年約有15萬(wàn)人死于結(jié)核病，其中青壯年人群占比高，若不能有效地控制、治療該疾病，結(jié)核病患者數(shù)將繼續(xù)增加[15]。準(zhǔn)確、快速的結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)，能夠高效地對(duì)廣泛耐藥結(jié)核病進(jìn)行篩查，而廣泛耐藥結(jié)核病的確定有利于避免耐藥性進(jìn)一步加重，也為結(jié)核疾病的治療提供了理論依據(jù)。

在中國(guó)，絕對(duì)濃度法被視為常規(guī)的結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)方法且仍在沿用，但該方法對(duì)混懸液制備、接種量的要求非常嚴(yán)格，操作者對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有著較大影響，且此法未對(duì)“耐藥”“敏感”進(jìn)行明確定義[16]。羅氏比例法的出現(xiàn)在結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中起到了較好的效用，該方法可對(duì)藥物敏感性試驗(yàn)中的接種量進(jìn)行校正，并在2種菌液濃度中提取菌群，提升了準(zhǔn)確性。液體培養(yǎng)基MIC指藥物能夠抑制微生物生長(zhǎng)的最低濃度，該指標(biāo)可用來(lái)評(píng)價(jià)藥物的殺菌或抑菌作用，檢測(cè)數(shù)值越小，意味著藥物效用越強(qiáng)。

本研究采用微量液體培養(yǎng)基MIC法與羅氏比例法對(duì)常用抗結(jié)核藥物進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，2種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)乙胺丁醇、二卡那霉素、利福平、異煙肼、氧氟沙星、卷曲霉素藥物的敏感性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 且2種檢測(cè)方法的一致性良好，在結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。由此提示，微量液體培養(yǎng)基MIC法也可作為結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的有效方法，且價(jià)格更低廉，檢驗(yàn)速度更快。王慧等[17]研究指出，采用微量液體培養(yǎng)基MIC法與羅氏比例法對(duì)結(jié)核菌株進(jìn)行乙胺丁醇、利福平、卷曲霉素藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種檢查方法的一致性較高，且微量液體培養(yǎng)基MIC法快速、廉價(jià)，具有經(jīng)濟(jì)適用性，與本研究結(jié)論相似。

MIC是實(shí)驗(yàn)室中重要的參考指標(biāo)，可以確認(rèn)抗微生物的抗菌劑，也可以檢測(cè)新的抗菌劑的活性，臨床治療感染性疾病時(shí)，醫(yī)生常會(huì)根據(jù)MIC來(lái)選擇抗生素并確認(rèn)抗生素用量; 在微生物學(xué)中, MIC為抗菌的最低濃度，可以對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)后的微生物生長(zhǎng)速度加以抑制，以保證培養(yǎng)的準(zhǔn)確度。羅氏比例法的檢測(cè)周期較長(zhǎng)，多數(shù)在4周后才能得到藥敏結(jié)果，且操作復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的要求較高，不利于快速建立藥敏檢測(cè)系統(tǒng)，此外培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，不利于推廣應(yīng)用。微量液體培養(yǎng)基MIC法的操作相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短, 7 d即可得到藥敏結(jié)果，可縮短患者的等待時(shí)間，且檢測(cè)結(jié)果很準(zhǔn)確，能夠作為耐多藥結(jié)核病的篩查方法。

綜上所述，微量液體培養(yǎng)基MIC法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)中與羅氏比例法有著良好的一致性，且檢驗(yàn)速度快，經(jīng)濟(jì)適用性好，能夠?yàn)榕R床指導(dǎo)結(jié)核病用藥提供參考。