單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞檢測、顆粒凝集法、膠體金法診斷兒童肺炎支原體感染的價(jià)值比較

許 華, 熊麗丹, 文 鵬

(江西省萍鄉(xiāng)市婦幼保健院 檢驗(yàn)科, 江西 萍鄉(xiāng), 337000)

支原體肺炎的病原體為肺炎支原體(MP), 該病以間質(zhì)性肺炎為主要病理改變，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。支原體肺炎早期臨床癥狀較輕，部分患者甚至無癥狀，偶爾并發(fā)咽痛、發(fā)熱、頭痛、咳嗽等一般呼吸道癥狀，但臨床也有死亡病例的相關(guān)報(bào)道[2]。該病發(fā)病季節(jié)不定，致病菌通過其頂端結(jié)構(gòu)黏附在機(jī)體宿主細(xì)胞表面，借助微管插入細(xì)胞內(nèi)吸取營養(yǎng)，細(xì)胞膜受到不同程度損傷，核酸酶被釋放，產(chǎn)生過氧化氫等，細(xì)胞發(fā)生溶解，上皮細(xì)胞腫脹繼而壞死[3]。MP感染能夠誘發(fā)小兒咳嗽變異性哮喘，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)多臟器衰竭，嚴(yán)重威脅生命健康[4]。目前，臨床診斷MP的方法較多，如血清學(xué)檢測、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測等，雖有較好的靈敏度與準(zhǔn)確度，但耗時(shí)較長[5]。膠體金技術(shù)具有快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于廣大基層檢驗(yàn)人員用來大批量檢測和大面積普查等[6]。血液分析指標(biāo)中，單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞(MONO/NEUT)指標(biāo)水平與支原體肺炎具有高度相關(guān)性。本研究比較了MONO/NEUT指標(biāo)檢測、顆粒凝集法檢測肺炎支原體(MP)抗體、膠體金法檢測肺炎支原體IgM抗體(MP-IgM)對兒童MP感染的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年8月—2020年6月本院收治的高度符合MP感染典型癥狀的患兒100例作為研究對象，其中男58例，女42例; 年齡60 d～14歲，平均(7.26±2.89)歲; 體質(zhì)量5～32 kg, 平均(25.33±1.36) kg; 身高0.43～1.40 m, 平均(0.77±0.23) m。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 患兒表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽，年長兒童伴有厭食、畏寒、頭痛、咽痛、胸骨下疼痛癥狀，偶見惡心、嘔吐及短暫的斑丘疹或蕁麻疹; ② 年齡>30 d者; ③ 依從性良好者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 先天性疾病患者; ② 自身免疫性疾病患者; ③ 合并惡性腫瘤者。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均同意參加本研究，并自愿簽署知情書。

1.2 方法

1.2.1 顆粒凝集法: 抽取患兒靜脈血標(biāo)本置于真空采血管中，在4 ℃條件下靜置1 h, 3 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min后分離血清，采用顆粒凝集法檢測MP抗體，血清抗體滴度持續(xù)≥1∶160為陽性, MP抗體診斷試劑購自日本富士公司。

1.2.2 膠體金法: 使用珠海麗珠試劑有限公司提供的肺炎支原體IgM抗體(MP-IgM)檢測試劑, 15 min內(nèi)出結(jié)果(以出現(xiàn)陽性檢測線為陽性)。將特異性抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體區(qū)域，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。若患兒病程<7 d, 應(yīng)于病程>7 d后進(jìn)行第2次檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

① 比較2種檢測方法對不同病程患兒的陽性檢出率; ② 比較2種檢測方法對不同年齡段患兒的陽性檢出率; ③ 比較2種檢測方法的陽性檢出率; ④ 以快速培養(yǎng)鑒定鏡檢法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，比較2種方法對兒童MP感染的診斷效能(靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度)。以a表示真陽性，以d表示真陰性，以c表示假陽性，以b表示假陰性，準(zhǔn)確度=(a+d)/總例數(shù)×100%, 靈敏度=a/(a+c)×100%, 特異度=d/(b+d)×100%。⑤ 比較MP陽性患兒與MP陰性患兒的MONO/NEUT指標(biāo)水平。⑥ 分析MP與MONO/NEUT指標(biāo)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 2種檢測方法對不同病程患兒的陽性檢出率

100例患兒中，有64例入院時(shí)病程<7 d, 于病程>7 d后進(jìn)行第2次檢測。以快速培養(yǎng)鑒定鏡檢法為“金標(biāo)準(zhǔn)”, 100例患兒中有68例為陽性。相同病程患兒中, 2種檢測方法的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 2種方法對病程≥7 d患兒的陽性檢出率均高于病程<7 d的患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2種檢測方法對不同病程患兒的陽性檢出率比較[n(%)]

2.2 2種檢測方法對不同年齡段患兒的陽性檢出率

相同年齡段患兒中, 2種檢測方法的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 2種方法對7～14歲患兒的陽性檢出率均高于60 d～6歲患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2種檢測方法對不同年齡段患兒的陽性檢出率比較[n(%)]

2.3 2種檢測方法的檢測結(jié)果

68例MP陽性患兒中，顆粒凝集法的陽性檢出率為86.76%(59/68), 膠體金法的陽性檢出率為89.71%(61/68), 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 顆粒凝集法、膠體金法的檢測結(jié)果比較

2.4 2種檢測方法的診斷效能

2種方法的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 顆粒凝集法、膠體金法的診斷效能比較 %

2.5 MP陽性患兒與MP陰性患兒的MONO/NEUT指標(biāo)水平分析

MP陽性組患兒MONO/NEUT指標(biāo)水平升高率高于MP陰性組, MONO/NEUT指標(biāo)水平正常率低于MP陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見表5。Kendall′s tau-b等級相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示, MONO/NEUT指標(biāo)水平與MP陽性結(jié)果呈顯著正相關(guān)(r=0.565,P<0.001), 即隨著MONO/NEUT指標(biāo)水平升高，MP陽性風(fēng)險(xiǎn)升高。

表5 MP陽性、MP陰性患兒MONO/NEUT指標(biāo)情況比較[n(%)]

3 討 論

呼吸道感染是臨床常見疾病之一，病死率較高，且地區(qū)性流行情況較為嚴(yán)重[7]。MP是引發(fā)肺炎的臨床常見病原體，屬于原核生物[8]。肺炎支原體肺炎是兒童肺炎的常見類型，占兒童獲得性肺炎的10%～30%, 在1～3歲兒童中較為常見[9]。兒童MP感染的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，臨床常會出現(xiàn)誤診情況，導(dǎo)致部分患兒錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)[10]。重癥患兒病情進(jìn)展迅速，可導(dǎo)致呼吸窘迫，嚴(yán)重者需進(jìn)行機(jī)械通氣，而部分患兒的神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等會受到損害。早期治療能夠有效改善患兒的治療效果及生活質(zhì)量，因此，快速有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷對于兒童MP感染的診治尤為重要[11]。

臨床資料[12]顯示, MP感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有血清學(xué)檢測、病原體的分離與培養(yǎng)以及PCR診斷等。病原體的分離與培養(yǎng)在臨床應(yīng)用時(shí)存在諸多缺點(diǎn)，如標(biāo)本中含有較少病原體、實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)時(shí)間較長、呼吸道污染所帶的雜菌數(shù)量較多以及陽性檢出率較低等，無法作為臨床診斷MP感染的有效方法[13]。PCR技術(shù)操作要求嚴(yán)格，需配備相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器、專業(yè)操作人員以及實(shí)驗(yàn)室等，限制了其臨床應(yīng)用。血清學(xué)檢測為臨床檢測MP感染的輔助方法，具有一定靈敏度與特異度，是利用純化的MP抗原包被明膠顆粒，與人類血清中的MP相結(jié)合產(chǎn)生凝集反應(yīng)[14], 但該法不能區(qū)分抗體類型，檢測時(shí)間長，對于大批量病菌檢測缺乏特異性。

人類感染支原體后, 1周內(nèi)出現(xiàn)IgM抗體, 20 d后出現(xiàn)IgG抗體，部分患者再次感染后會出現(xiàn)特異性IgM抗體檢測滴度較低的情況，有時(shí)甚至檢測不到。對于免疫功能低下的患者或正在接受免疫抑制治療的患者來說，檢測容易出現(xiàn)假陽性，血清學(xué)抗體檢測的參考價(jià)值有限。氯金酸在還原劑如白磷、枸櫞酸鈉、抗壞血酸、鞣酸等的作用下，能夠聚合成一定大小的金顆粒，且因?yàn)殪o電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。這種因靜電作用而成的穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金法又名斑點(diǎn)免疫金滲濾實(shí)驗(yàn)、金標(biāo)法及一步法，膠體金為示蹤標(biāo)志物，用于抗原抗體的免疫標(biāo)記[15]。在MP感染的診斷中，膠體金法利用MP抗原固相硝酸纖維素膜及滲濾原理，檢測IgM抗體，用于臨床輔助診斷[16]。膠體金法的基本原理是弱堿環(huán)境下膠體金帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)相結(jié)合，且還能與其他生物大分子結(jié)合，在免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[17]。

本研究結(jié)果顯示，以快速培養(yǎng)鑒定鏡檢法為“金標(biāo)準(zhǔn)”, 100例患兒中有68例為病理陽性; 相同病程患兒中，2種檢測方法的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 2種方法對病程≥7 d患兒的陽性檢出率均高于病程<7 d的患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 相同年齡段患兒中，2種檢測方法的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 2種方法對7～14歲患兒的陽性檢出率均高于60 d～6歲患兒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此表明，MP感染的年齡特征和病程特征較為明確，隨著患兒年齡的增長以及病程的延長，2種檢測方法的陽性檢出率均上升，即6～14歲和病程≥7 d兒童屬于易感人群。本研究結(jié)果還顯示，68例MP陽性患兒中，顆粒凝集法的陽性檢出率為86.76%, 膠體金法的陽性檢出率89.71%, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，顆粒凝集法的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度與膠體金法比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此提示，與靈敏度、特異度較高的顆粒凝集法相比，膠體金法有著相似的診斷效能，但在耗時(shí)、儀器需求、實(shí)驗(yàn)室條件方面存在顯著優(yōu)勢。此外，膠體金免疫層析技術(shù)目前已較為成熟，試劑盒也得到了工藝優(yōu)化，發(fā)展為診斷試紙條，使用十分方便。

單核細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，與中性粒細(xì)胞比較，其含有更多的非特異性脂酶，且具有更強(qiáng)的吞噬作用，機(jī)體發(fā)生炎癥或相關(guān)疾病可引起單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目變化，而MONO/NEUT指標(biāo)與支原體肺炎高度相關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示, MP陽性患兒MONO/NEUT指標(biāo)水平升高率顯著高于MP陰性患兒，且MONO/NEUT指標(biāo)變化與MP陽性結(jié)果呈顯著正相關(guān)，故推測膠體金法聯(lián)合應(yīng)用MONO/NEUT指標(biāo)檢測對MP感染具有很好的診斷價(jià)值。但本研究仍存在不足之處，一是樣本納入量較小(膠體金法適合大批量樣本操作)，二是未采用實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行對比，有待今后改進(jìn)方案進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，對于兒童MP感染，膠體金法可獲得與顆粒凝集法相似的臨床診斷結(jié)果，且操作方法更簡單，耗時(shí)更少，對檢測人員的專業(yè)素質(zhì)要求更低，而MONO/NEUT指標(biāo)水平與MP陽性結(jié)果呈顯著正相關(guān)，故推薦將膠體金法聯(lián)合MONO/NEUT指標(biāo)檢測應(yīng)用于MP感染的臨床診斷中，以獲得更優(yōu)的診斷效能。