上海市長(zhǎng)寧區(qū)2 006例新生兒15個(gè)遺傳性耳聾基因突變位點(diǎn)的篩查分析

羅會(huì)濤, 蔡 成, 李志奇, 陳 璇, 魯巧珍, 黃 潔, 李 銳,李 波, 張 靜, 吳雙霜, 蔡宛儒, 莊于修

(1. 華東師范大學(xué)附屬婦幼保健院, 上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院 新生兒科, 上海, 200050;2. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 新生兒科, 上海, 200062)

耳聾是較為常見(jiàn)的出生缺陷，研究[1]統(tǒng)計(jì)，每1 000例新生兒中就有1例患有重度或極重度聽(tīng)力異常。約60%的耳聾是由遺傳缺陷引起的，約80%遺傳性耳聾為非綜合性耳聾，即不伴有其他癥狀的耳聾[2]。王秋菊等[3]提出，實(shí)施耳聾基因篩查可以早期發(fā)現(xiàn)部分與遺傳相關(guān)的高危耳聾新生兒和遲發(fā)性耳聾新生兒。本研究對(duì)上海市長(zhǎng)寧區(qū)2 006例新生兒進(jìn)行耳聾常見(jiàn)的4個(gè)基因的15個(gè)位點(diǎn)的篩查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取上海市長(zhǎng)寧區(qū)2018年8—11月出生的新生兒2 006例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本采集: 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，新生兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)后，由經(jīng)過(guò)專(zhuān)項(xiàng)培訓(xùn)的新生兒門(mén)診護(hù)理人員采集新生兒足跟血，置于采血濾紙片上，晾干后 0～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取: 采用打孔器取1個(gè)直徑6 mm干血斑標(biāo)本，采用濾紙干血斑核酸提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。

1.2.3 PCR擴(kuò)增: 將基因組DNA 5 μL、PCR擴(kuò)增試劑混合物20 μL混合。PCR總反應(yīng)時(shí)間約3.3 h, 按照被檢樣品數(shù)目的3倍準(zhǔn)備離心管，分為A、B、C共3個(gè)體系，并在管上標(biāo)記樣品編號(hào)，一一對(duì)應(yīng)，完全混合，進(jìn)行多重PCR。

1.2.4 基因芯片檢測(cè): 采用晶芯?15項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)芯片試劑盒[北京博奧生物有限公司，國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第3400832號(hào)]。該試劑盒包括PCR擴(kuò)增引物混合物、PCR擴(kuò)增試劑混合物、雜交試劑、洗滌試劑、芯片和蓋片等。該試劑盒采用了基因芯片的原理，通過(guò)芯片雜交掃描數(shù)據(jù)分析，可同時(shí)檢測(cè)與中國(guó)人耳聾相關(guān)的常見(jiàn)的4個(gè)耳聾基因(GJB2, GJB3, SLC26A4, 12S rRNA)的15個(gè)突變熱點(diǎn)。15個(gè)位點(diǎn)分別是GJB2基因的35 del G、176_191 del 16、235delC和299_300 del AT, GJB3基因的538 C>T, SLC26A4基因的IVS7-2 A>G、2168 A>G、1174 A>T、1226 G>A、1229 C>T、IVS15+5 G>A、1975 G>C、2027 T>A, 以及線粒體12S rRNA基因的1555 A>G和1494 C>T。

1.2.5 結(jié)果判讀: 檢測(cè)結(jié)果由晶芯?耳聾基因檢測(cè)分析系統(tǒng)(微陣列芯片法)自動(dòng)判讀。

2 結(jié) 果

2 006例血樣中，耳聾基因中單基因單雜合突變者88例，攜帶率為4.39%, 其中包括GJB2基因雜合突變40例(攜帶率為1.99%); SLC26A4基因雜合突變38例(攜帶率為1.89%); 線粒體12S rRNA基因均質(zhì)或異質(zhì)突變4例(攜帶率為0.19%); GJB3基因雜合突變6例(攜帶率為0.30%); 在檢測(cè)的4個(gè)耳聾相關(guān)基因的15基因位點(diǎn)中，共有11個(gè)基因位點(diǎn)存在突變，另外4個(gè)基因位點(diǎn)未檢出，見(jiàn)表1。此外，另有雙雜合突變2例，均為GJB2 235delC、SLC26A4 IVS7-2A>G雙雜合突變。

表1 2 006例新生兒耳聾基因篩查各基因單雜合位點(diǎn)突變率

3 討 論

研究[4]發(fā)現(xiàn)，約50%的學(xué)語(yǔ)前聽(tīng)力障礙都是由遺傳因素引起。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，中國(guó)新生兒先天性耳聾的發(fā)生率為0.93%～7.70%, 新生兒中耳聾基因攜帶率達(dá)4.70%。本院根據(jù)國(guó)家及上海市相關(guān)政策，已經(jīng)常規(guī)免費(fèi)開(kāi)展新生兒聽(tīng)力篩查，對(duì)所有的新生兒應(yīng)用耳聲發(fā)射(OAE)測(cè)試技術(shù)進(jìn)行聽(tīng)力篩查，并取得了一定的社會(huì)效益，但該項(xiàng)新生兒聽(tīng)力篩查技術(shù)不能預(yù)測(cè)遲發(fā)性聽(tīng)力障礙或早期發(fā)現(xiàn)先天性耳聾。為了降低先天性耳聾導(dǎo)致聽(tīng)力障礙的發(fā)生率，可以聯(lián)合進(jìn)行聽(tīng)力和耳聾易感基因的篩查，以提高先天性耳聾的篩出率[5]。

目前，研究人員依據(jù)耳聾相關(guān)的基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)與耳聾有關(guān)的基因多達(dá)200多種，中國(guó)最常見(jiàn)耳聾基因分別為GJB2 基因、線粒體DNA 12Sr RNA 基因、SLC26A4 基因、GJB3 基因[7]。GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA和GJB3也是非綜合征性聾患者最常見(jiàn)的致聾基因[8-10]。ZOU Y等[11]研究表明，上述基因突變所致的非綜合征性聾在不同地域、不同種族間存在較大差異，包括不同的突變頻率及突變形式。GJB2是發(fā)病率最高的遺傳性聾致病基因, GJB2導(dǎo)致的非綜合征性聾是常染色體隱性遺傳病，可能致病位點(diǎn)的純合突變或者復(fù)合雜合突變均可引發(fā)非綜合征性聾[12]。本研究中, GJB2基因突變率為45.4%(40/88), 與全國(guó)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查[5]報(bào)道的21.01%的耳聾患者攜帶有GJB2基因突變的結(jié)果較為一致。

本研究2 006例血樣結(jié)果顯示，耳聾基因中單基因單雜合突變者88例，攜帶率為4.39%, 其中GJB3基因雜合突變6例(攜帶率為0.30%)。GJB3基因突變可以導(dǎo)致常染色體隱性和常染色體顯性遺傳性耳聾[13]。HUANG S等[14]研究顯示, GJB3 c. 538 C>T雜合突變的攜帶者臨床表現(xiàn)為遲發(fā)型高頻聽(tīng)力下降。因此，建議該基因攜帶者定期隨訪并檢測(cè)聽(tīng)力功能，及早進(jìn)行相應(yīng)的臨床醫(yī)學(xué)和聽(tīng)力學(xué)干預(yù)，避免發(fā)生聽(tīng)力障礙而影響生活質(zhì)量。

目前，中國(guó)許多省市已經(jīng)常規(guī)開(kāi)展新生兒聽(tīng)力篩查，并納入政府的惠民項(xiàng)目，目前各家醫(yī)療機(jī)構(gòu)常用的方法是耳聲發(fā)射(OAE)和自動(dòng)聽(tīng)性腦干反應(yīng)(AABR)。本院采用OAE進(jìn)行新生兒出生聽(tīng)力篩查，未通過(guò)者在出生后3周再行OAE和AABR篩查，陽(yáng)性者轉(zhuǎn)聽(tīng)力診斷治療中心進(jìn)一步診治[15-16]。目前，許多臨床工作者發(fā)現(xiàn)上述物理篩查方法在實(shí)踐中仍有許多欠缺，如對(duì)藥物性及遲發(fā)性耳聾的篩查存在漏檢，對(duì)先天性耳聾的確診需要經(jīng)過(guò)反復(fù)隨訪，臨床確診時(shí)間較長(zhǎng)，可能要到2歲左右才能確診，錯(cuò)過(guò)了早期干預(yù)和早期治療的時(shí)間窗口[17]。因此作者認(rèn)為，有條件的地區(qū)可以實(shí)施新生兒先天性耳聾相關(guān)基因早期篩查，對(duì)篩查出來(lái)的先天性耳聾基因攜帶者進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)，以改善患兒預(yù)后，提高患兒生活質(zhì)量，更好地幫助患兒融入社會(huì)[18]。

綜上所述，先天性耳聾基因篩查有助于了解耳聾基因突變熱點(diǎn)情況，可以發(fā)現(xiàn)耳聾基因攜帶患兒，有利于開(kāi)展早期診斷和早期醫(yī)學(xué)干預(yù)，降低耳聾發(fā)病率。