RP-HPLC法測(cè)定可溶微針貼片中川芎嗪的含量

趙偉曼，孫 瑞，鄭利潔，楊健輝，李 敏，呂小東，董 雨，王清清

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物分析教研室，安徽 蚌埠 233000)

微針作為一種新型的透皮給藥劑型，能突破傳統(tǒng)經(jīng)皮給藥最大的屏障 (角質(zhì)層) ，并且可以通過調(diào)節(jié)尺寸，不觸及或較少觸及痛覺神經(jīng)，可實(shí)現(xiàn)無痛給藥[1]?？扇芪⑨?dissolving microneedles，DMNs)由水溶性或生物可降解聚合物材料組成，他們?cè)O(shè)計(jì)用于釋放封裝的藥物，同時(shí)可以在皮膚內(nèi)徹底溶解或降解而不產(chǎn)生生物危險(xiǎn)的廢物[2-3]。目前可溶微針不光用于一些生物大分子藥物如疫苗、多肽、激素和核酸等的經(jīng)皮給藥[4-6]，越來越多的研究者也關(guān)注它在一些小分子給藥的應(yīng)用[7-8]。可溶微針在經(jīng)皮給藥方面顯示出了令人矚目的優(yōu)勢(shì)和前景。

川芎嗪(Tetramethylpy razine，TMP)，又稱2，3，5，6-四甲基吡嗪，是從中藥川芎分離提取的生物堿類物質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、抗炎等藥理作用。近年來，越來越多的研究表明川芎嗪可以用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療[9-11]。本實(shí)驗(yàn)選擇右旋糖酐(dextran，DEX) 作為針部輔料，聚乙烯吡咯烷酮( polyvinyl pyrrolidone，PVP K90) 為基層輔料，川芎嗪作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型藥物，兩步注模干燥法制備川芎嗪可溶微針貼片[12]。

川芎嗪的定量分析法包括電位滴定法、紫外分光光度法、和色譜法等[13-16]。含量測(cè)定方法的選擇要與待測(cè)物質(zhì)所處的環(huán)境相適宜，因可溶微針貼片中還存在其他制針材料成分，且藥物本身含量較低，所以本研究建立一種反相高效液相色譜法用于準(zhǔn)確測(cè)定可溶微針中的川芎嗪含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，為川芎嗪可溶微針貼片的后期質(zhì)量研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器高效液相色譜儀(日本島津，LC-16)；精密電子分析天平(梅特勒-托利多，XP 205)； 臺(tái)式高速離心機(jī)(賽默飛，Muitifuge X1R)；紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，TU-1901)。

1.2 試劑及藥品川芎嗪可溶微針貼片(實(shí)驗(yàn)室自制)；磷酸川芎嗪對(duì)照品(武漢欣欣佳麗生物科技有限公司，批號(hào)：201714，純度>98%)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K90，德國(guó)BASF，批號(hào)：L96014768E0)；右旋糖酐(Dextran，MW ca 40000，美國(guó)Alfa Aesar，批號(hào)：R16D019)；甲醇(上海麥克林生化科技有限公司，色譜純)；水為超純水。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備 (1)川芎嗪儲(chǔ)備液的制備 精密稱取磷酸川芎嗪對(duì)照品10.39 mg，用超純水定容于100 mL容量瓶，儲(chǔ)備液濃度為1039 μg/mL。(2)制針材料儲(chǔ)備液的制備 精密稱取Dex 10 mg和PVP K90 10mg，用超純水于10 mL容量瓶中定容配制成濃度為1 mg/mL可溶微針制針材料儲(chǔ)備液。(3)供試品溶液的制備 參考本實(shí)驗(yàn)前期研究[17]，用刀片將微針針部全部取下來，溶于1 mL超純水中，作為供試品溶液。

1.3.2 色譜條件 色譜柱：Inertsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相為超純水，B相為甲醇，比例為60∶40；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)取1.3.1制備的四種溶液(Dex溶液，PVP K90溶液，TMP對(duì)照品溶液，可溶微針供試品溶液)，按照1.3.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。如圖1所示，川芎嗪保留時(shí)間為7.7 min，制針材料溶液在此時(shí)間無色譜峰出現(xiàn)，表明在此色譜條件下，制針輔料對(duì)川芎嗪的含量測(cè)定無干擾。

2.2 線性試驗(yàn)精密吸取一定量川芎嗪儲(chǔ)備液并用超純水稀釋，得到濃度分別為1.039 μg/mL、2.078 μg/mL、5.195 μg/mL、10.39 μg/mL、25.975 μg/mL、51.95 μg/mL、103.9 μg/mL、129.875 μg/mL的一系列川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液。進(jìn)入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，以川芎嗪濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲，線性回歸方程為Y=39177X-3118.1 (R2=0.9999)。結(jié)果表明，川芎嗪在1.039～129.875 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見圖2)。

圖1 Dex、PVP K90、磷酸川芎嗪和川芎嗪可溶微針的專屬性試驗(yàn)色譜圖

圖2 川芎嗪的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度試驗(yàn)

2.3.1 日內(nèi)精密度 取濃度為2.078 μg/mL、25.975 μg/mL、103.9 μg/mL的川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照1.3.2項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣三次。結(jié)果見表1，所選取的低、中、高三個(gè)濃度的日內(nèi)精密度RSD值均小于2%，平均RSD為1.89%。表明本方法的日內(nèi)精密度良好。

表1 川芎嗪的日內(nèi)精密度

2.3.2 日間精密度 取濃度為2.078 μg/mL、25.975 μg/mL、103.9 μg/mL的川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照川芎嗪色譜條件連續(xù)進(jìn)樣3 d，記錄峰面積。結(jié)果見表2，所選取的低、中、高三個(gè)濃度的日間精密度RSD值均小于3%，平均RSD為1.63%。表明本方法的日間精密度良好。

表2 川芎嗪的日間精密度

2.4 加樣回收率試驗(yàn)取川芎嗪、DEX和PVP K90儲(chǔ)備液，按照下面配比配制藥物輔料混合溶液?；旌陷o料與川芎嗪比分別為20∶1，10∶1和5∶1，川芎嗪的濃度分別為12.9875 μg/mL、25.975 μg/mL和51.95 μg/mL，其中混合輔料濃度不變，DEX和PVP K90濃度均為100 μg/mL。將各混合液按照川芎嗪色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并帶入線性方程計(jì)算濃度及回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，川芎嗪的平均回收率在97.21%～98.72%之間。RSD均小于2%，平均RSD為1.42%。

表3 川芎嗪的加樣回收率

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)取實(shí)驗(yàn)室本自制的同一批6片川芎嗪可溶微針貼片，分別用手術(shù)刀片取每片微針的針部，溶于1 mL超純水中。注入高效液相色譜儀，按照1.3.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算針部中川芎嗪的載藥量，平均每片可溶微針貼片針部的川芎嗪載藥量為136.28 μg，RSD為2.23%，方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取2.5項(xiàng)下某一可溶微針貼片溶液，分別于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積RSD值為0.93%(n=6)，結(jié)果表明可溶微針貼片供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

在現(xiàn)行的2015版《中國(guó)藥典》中，川芎嗪原料藥采用電位滴定法測(cè)定含量，因其具有堿性，選擇高氯酸進(jìn)行非水滴定；而對(duì)于制劑如川芎嗪片和川芎嗪膠囊則采用高效液相色譜法測(cè)定含量。也有文獻(xiàn)報(bào)道為了排除輔料及雜質(zhì)的干擾可以采用紫外分光光度法測(cè)定注射液中川芎嗪的含量。采用紫外分光光度計(jì)對(duì)磷酸川芎嗪對(duì)照品溶液及制針材料溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)磷酸川芎嗪在280 nm有最大吸收，并且專屬性較好，所以選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。與光譜法比較，高效液相色譜法靈敏度較高，可溶微針貼片中載藥量較小，所以選擇高效液相色譜法來測(cè)定含量。采用藥典中色譜條件的流動(dòng)相甲醇-水(45∶55)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，川芎嗪峰形較差，而將流動(dòng)相比例調(diào)整為40∶60，色譜峰峰形較好，且輔料溶液不干擾測(cè)定。所以最終選擇甲醇-水(40∶60)作為流動(dòng)相。

本文采用RP- HPLC 法測(cè)定川芎嗪可溶微針貼片中川芎嗪的含量，專屬性強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度良好，重復(fù)性較好，方法簡(jiǎn)便可行，結(jié)果可靠，可用于測(cè)定可溶微針貼片中川芎嗪的含量，并為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可溶微針提供方法依據(jù)。