芪術(shù)抗癌方對(duì)肝癌HepG₂細(xì)胞增殖和凋亡的影響

馮文杏　周小舟　韓志毅　孫新鋒　馬文峰　張衛(wèi)

摘要 目的：探討芪術(shù)抗癌方對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控作用。方法：體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，加入不同濃度芪術(shù)抗癌方（0，250，500，1 000 mg/L）處理48 h。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力，采用免疫印記法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白c-Caspase-3和c-Caspase-9表達(dá)變化。結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示芪術(shù)抗癌方可呈濃度依賴性抑制HepG2細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），1 000 mg/L組抑制效果最好，芪術(shù)抗癌方刺激HepG2細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白c-Caspase3及c-Caspase9表達(dá)增加，呈濃度依賴性，在1 000 mg/L組達(dá)到最高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（c-Caspase3增加1.83倍，P<0.05;c-Caspase9增加1.06倍，P<0.05）。結(jié)論：芪術(shù)抗癌方可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞 芪術(shù)抗癌方;肝癌;HepG2細(xì)胞;增殖;凋亡;Caspase-3;Caspase-9;機(jī)制研究

Abstract Objective：To study the effects of Qizhu Kangai Formula on the proliferation and apoptosis of HepG2 heptoma cells of liver cancer.Methods：The HepG2 cells were cultured in vitro and treated with different concentration of Qizhu Kangai Formula （0，250，500，1 000 mg/L ） for 48 h.The living cells were detected by cell counting kit 8 （ CCK8 ） and the protein expression of c-caspase3 and c-caspase9 were observed by Western-blot.Results：CCK8 showed that Qizhu Kangai Formula could inhibit HepG2 cells proliferation in concentration-dependent manner and had significant differences with the control group （P<0.05）.Among them，the 1000 mg/L group had the best inhibition effects.Further studies found that the expression of the apoptotic proteins c-caspase3 and c-caspase9 increased after the stimulating HepG2 cells by Qizhu Kangai Formula and was concentration-dependent and was highest in the 1000 mg/L group with statistical significance （ c-caspase3 increased 1.83 times，P<0.05; c-caspase9 increases by 1.06 times，P<0.05 ）.Conclusion：Qizhu Kangai Formula could inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 heptoma cells.

Keywords Qizhu Kangai Formula ; Liver cancer; HepG2 cells; Proliferation; Apoptosis; Caspase-3; Caspase-9; Mechanism research

中圖分類(lèi)號(hào)：R289.5;R735.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.015

據(jù)流行病學(xué)研究顯示，肝癌是世界第6大最常見(jiàn)惡性腫瘤和第2位癌癥相關(guān)死亡原因[1-2]，其發(fā)病隱匿，很多患者到晚期才診斷，僅僅1/3的新確診患者適合治愈性治療[3]，終晚期患者是不可治療的且大多數(shù)生存期為3～6個(gè)月[4]，多激酶抑制劑索拉菲尼是美國(guó)食品藥品管理局（FDA）唯一批準(zhǔn)的系統(tǒng)治療晚期肝癌藥物，可以延長(zhǎng)生存期3個(gè)月[5]。中醫(yī)藥在肝癌綜合治療中顯示了好的療效[6]，能增效減毒。周小舟教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，基于郭振球教授抗纖靈方的基礎(chǔ)上，創(chuàng)立芪術(shù)抗癌方，能明顯提高原發(fā)性肝癌患者的生命質(zhì)量及延長(zhǎng)生存期[7]，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究采用CCK8法和免疫印跡法探索芪術(shù)抗癌方在體外對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控的作用，從而為其臨床應(yīng)用提供一些理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于武漢博士德公司（批號(hào)：20161209）。細(xì)胞培養(yǎng)用含10%FBS+1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中（95%濕度，5%CO2）。每1～2天換液1次。細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）溶液消化、傳代。

1.1.2 藥物 芪術(shù)抗癌方凍干粉，芪術(shù)抗癌方（柴胡6 g、白芍10 g、雞內(nèi)金10 g、莪術(shù)10 g、黃芪10 g、炙甘草5 g、炒白術(shù)15 g），藥物浸泡1 h，用8倍的蒸餾水煎煮2次，過(guò)濾煎液，12 000×g離心2次，每次30 min，取上清液凍干，密封儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱（深圳市中醫(yī)院制劑科制備）。

芪術(shù)抗癌方浸提液制備：無(wú)菌離心管中用DMEM培養(yǎng)液充分溶解，0.22 μm微孔濾器過(guò)濾，得到濃度為1 000 mg/L的母液，DMEM稀釋分別獲得其他500 mg/L和250 mg/L濃度使用。浸提液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 試劑與儀器 超凈工作臺(tái)（美國(guó)ESCO公司，型號(hào)：ACB-4E1）;CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)：BBD6220）;全自動(dòng)凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：ChemiDoc TMMP）;垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：1658003）;酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司，型號(hào)：synergy2）。CCK8檢測(cè)試劑盒（日本DojinDo公司，貨號(hào)：CK04），c-Caspase-3一抗（英國(guó)Bioss，貨號(hào)：Bs-0081R）、β-actin一抗（Sigma，貨號(hào)：MAB1501）、c-caspase9一抗（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：Ab202068）和鼠兔二抗（CST，貨號(hào)：7076P2、7074P2）。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為對(duì)照組和芪術(shù)抗癌方濃度分別為250，500，1 000 mg/L組4組。

1.2.2 干預(yù) 對(duì)照組細(xì)胞予以DMEM培養(yǎng)，芪術(shù)抗癌方組的細(xì)胞予以相應(yīng)濃度浸提液干預(yù)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性：將指數(shù)生長(zhǎng)的HepG2按1×106/孔接種在96孔板，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中（95%濕度，5%CO2），24 h后棄去培養(yǎng)基。按1.2.1和1.2.2分組及干預(yù)，每孔200 μL，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入10 μLCCK8試劑，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)時(shí)各孔A值。

免疫印跡法檢測(cè)c-Caspase-3、c-Caspase-9蛋白表達(dá)：HepG2細(xì)胞分組給藥培養(yǎng)48 h后，吸除培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿置于冰上，PBS洗2次，加入1×細(xì)胞裂解液120 μL/皿覆蓋均勻，搖床上裂解 10 min。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞蛋白并移入預(yù)冷的1.5 mL EP管中，離心（4 ℃，12 000×g，10 min）后將上清轉(zhuǎn)入另-1.5 mL EP管。采用Bradford法測(cè)蛋白濃度并配平。100 ℃水浴10 min變性，離心后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉60 min、孵對(duì)應(yīng)一抗、二抗曝光顯影、圖像分析。采用Image-Lab軟件（美國(guó)Bio-Rad公司）進(jìn)行電泳條帶灰度值分析，其結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行兩兩比較，方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪術(shù)抗癌方對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

抗癌方處理HepG2細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，肝癌細(xì)胞成活率逐漸下降?？拱┓綄?duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制呈濃度依賴性，濃度升高，抑制效果更加明顯。與對(duì)照組比較，250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 芪術(shù)抗癌方對(duì)HepG2凋亡的影響

不同濃度芪術(shù)抗癌方刺激HepG2細(xì)胞48 h均可增加凋亡相關(guān)蛋白c-Caspase-3、c-Caspase-9的表達(dá)，且呈藥物濃度依賴性增加。與對(duì)照組比較，濃度為1 000 mg/L時(shí)c-Caspase-3、c-Caspase-9蛋白表達(dá)分別增加1.83倍、1.06倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

周小舟教授認(rèn)為肝癌的主要病因是正氣不足與外感疫毒相互作用所致，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，即HBV、HCV、過(guò)度飲酒等病原因素與機(jī)體免疫失調(diào)的綜合結(jié)果[8]。通過(guò)臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)肝癌的主要證型是氣虛血瘀[9]，針對(duì)此病機(jī)，芪術(shù)抗癌方以扶正祛瘀為原則，方中黃芪、黨參、白術(shù)、山藥等健脾益氣，莪術(shù)活血化瘀，雞內(nèi)金軟堅(jiān)散結(jié)，白花蛇舌草清邪毒。全方扶正為主，佐以祛邪，臨床療效顯著。

增殖與凋亡之間的平衡失調(diào)是肝癌發(fā)生發(fā)展的一個(gè)潛在因素，通常增殖信號(hào)激活而調(diào)亡過(guò)程抑制，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生存，然后增殖[10]，同時(shí)增殖凋亡的異常與終晚期肝癌系統(tǒng)治療藥物索拉菲尼的耐藥相關(guān)[11]。本研究中CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果顯示芪術(shù)抗癌方對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有抑制作用，呈濃度依賴。

細(xì)胞凋亡是一種維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的程序性死亡，主要分為死亡受體途徑和線粒體途徑。死亡受體途徑是通過(guò)死亡配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合的外源性形式激活Caspase-8，繼之激活Caspase-3。線粒體途徑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的主要途徑，內(nèi)在信號(hào)壓力下線粒體外膜通透性（MOMP）增加，釋放細(xì)胞色素C，Caspase-9與活化的APAF1結(jié)合形成凋亡復(fù)合體后被激活，活化的Caspase-9隨后激活Caspase-3。Caspases本來(lái)結(jié)構(gòu)上是不活躍的，需要蛋白水解過(guò)程裂解激活，它們可以自我激活或者相互之間發(fā)生類(lèi)似級(jí)聯(lián)過(guò)程，活化的Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵“劊子手”[12]，許多研究表明誘導(dǎo)凋亡對(duì)抑制肝癌的發(fā)展有重要意義[13-15]，抗癌方既往研究顯示可以提高凋亡相關(guān)基因P53表達(dá)[16]。本研究中凋亡相關(guān)蛋白c-Caspase-9和c-Caspase-3均隨著藥物濃度的增加表達(dá)上調(diào)，推測(cè)抗癌方對(duì)肝癌細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用，可能是通過(guò)激活線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，芪術(shù)抗癌方可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而凋亡具體上游觸發(fā)機(jī)制尚不明確，待進(jìn)一步研究。

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（2019-03-25收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）