黃芩苷介導光動力療法治療宮頸癌的療效及其機制研究

郭婕　潘彥舒　龐大承　牟天龍

摘要 目的：觀察黃芩苷介導光動力療法（PDT）治療宮頸癌的療效，探討其可能機制。方法：將宮頸癌Hela細胞懸液注入裸鼠皮下，構建移植瘤模型，成模后隨機均勻分為模型組、黃芩苷-PDT觀察組、PDT觀察組、姜黃素-PDT觀察組4組，每組18只。PDT觀察組：腫瘤周圍注射100 μL生理鹽水，6 h后瘤周注射硼砂緩沖液100 μL后行PDT治療，照射劑量為80 J/cm2（435 nm波長，0.60 A，0.54 W，距離腫瘤表面3～5 cm，照射2 min 28 s）;黃芩苷-PDT觀察組：以80 μg/mL的黃芩苷溶液100 μL代替生理鹽水，其他同PDT觀察組;姜黃素-PDT觀察組：以50 μmol/L的姜黃素溶液100 μL代替生理鹽水，其他同PDT觀察組;模型組：以自然光照代替PDT治療，其他同PDT觀察組。治療1 d后，各組處死6只取材腫瘤組織制備成病理切片，HE染色觀察組織病理學改變;另外處死6只，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測腫瘤組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達情況;剩余6只分別于治療第1、3、7、14 d測量腫瘤體積，計算腫瘤體積抑瘤率。結果：模型組腫瘤體積持續(xù)增大，光動力治療1 d后腫瘤組織出現(xiàn)壞死，腫瘤生長受到抑制，黃芩苷-PDT觀察組和姜黃素-PDT觀察組腫瘤體積在3 d內(nèi)均無增大趨勢，隨后逐漸增大。黃芩苷-PDT觀察組Bcl-2和Bax蛋白表達與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：黃芩苷介導的PDT能夠有效抑制宮頸癌體外移植瘤的增長，其機制可能通過促進癌細胞凋亡發(fā)揮作用。

關鍵詞 黃芩苷;姜黃素;光動力療法;腫瘤抑制;凋亡機制

Abstract Objective：To observe the therapeutic effects of baicalin-mediated photodynamic therapy （PDT） on cervical cancer and explore its possible mechanism. Methods：A cervical cancer Hela cell suspension was injected subcutaneously into nude mice to construct a transplanted tumor model. After the model was formed， it was randomly and evenly divided into 4 groups： a model group， a baicalin-PDT treatment group， a PDT treatment group， and a curcumin-PDT treatment group ， with 18 cases in each group. PDT treatment group： 100μL of saline was injected around the tumor， and 100 μL of borax buffer was injected around the tumor 6 hours later， followed by PDT treatment. The irradiation dose was 80J/cm2 （435nm wavelength， 0.60A， 0.54W， 3-5cm from the tumor surface， irradiation 2 min28s）; Baicalin-PDT treatment group： 100 μL of baicalin solution at 80 μg/mL instead of normal saline， others were the same as PDT treatment group; curcumin-PDT treatment group： 50 μmol/L curcumin solution instead of 100 ml normal saline， others were the same as PDT treatment group; model group： natural light instead of PDT treatment， others were the same as PDT treatment group. After 1 day of treatment， 6 rats were sacrificed in each group and their tumor tissues were prepared for pathological sections， and the histopathological changes were observed by HE staining; another 6 were sacrificed， and the expression of Bcl-2 and Bax proteins in tumor tissues were detected by Western blot technology; their tumor volume of 6 remaining rats， was measured only on the 1st， 3rd， 7th， and 14th days of treatment， and the tumor volume inhibition rate was also calculated. Results：The tumor volume in the model group continued to increase. Tumor tissue appeared necrosis and tumor growth was inhibited after 1 day of photodynamic therapy. The tumor volume of baicalin-PDT treatment group and curcumin-PDT treatment group did not increase within 3 days， and then gradually increased. The expression of Bcl-2 and Bax proteins in the baicalin-PDT treatment group was significantly different from that in the model group （P<0.01）. Conclusion：Baicalin-mediated PDT can effectively inhibit the growth of cervical cancer xenografts in vitro， and its mechanism may play a role in promoting cancer cell apoptosis.

Keywords Baicalin; Curcumin; Photodynamic therapy; Tumor suppression; Apoptosis mechanism

中圖分類號：R284;R711.74文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.013

宮頸癌具有發(fā)病率高、致死率高以及發(fā)病年齡趨于年輕化的特點，目前在危害女性生命健康的惡性腫瘤排名中，位居第2位[1]，給女性的身心健康帶來嚴重的威脅。宮頸癌的死亡率位居全球癌癥死亡率的第4位[2]。世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，全球宮頸癌新發(fā)病例數(shù)為52.8萬，死亡人數(shù)為26.6萬，其中85%的病例發(fā)生在中低收入國家。我國近年來子宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢，子宮頸癌的防治作為公共衛(wèi)生問題已引起中國政府的高度重視和關注[3]。

在諸多治療宮頸癌的療法中，光動力療法（Photodynaminc Therapy，PDT）是一種在腫瘤治療方面有著廣闊前景的新型療法，該療法具有對病變部位造成的創(chuàng)傷小、定位精準、治療時間短、操作簡便、價格低等優(yōu)點[4-5]，而宮頸上皮是由宮頸陰道部鱗狀上皮和宮頸管柱狀上皮共同組成，宮頸鱗狀上皮一般厚度為1 mm[6]，當其發(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤變（Cervical Intraepithe-lial Neoplasia，CIN）時，其局限于宮頸上皮基底膜以上的上皮組織內(nèi)，這部分組織厚2～3 mm。當CIN發(fā)展至早期宮頸微小浸潤癌時的浸潤深度在3～5 mm[7]。對于大多數(shù)組織而言，PDT作用深度為5～10 mm[8]，因此使得PDT可以治療CIN和宮頸癌;加之宮頸部位特殊，容易暴露，使宮頸病變成為“淺表”病變，局部給藥和光照十分方便，對局部作用針對性強，對機體產(chǎn)生的不良反應較全身用藥后小，不易產(chǎn)生耐藥性[9]，從而使得PDT在治療宮頸病變方面更顯優(yōu)勢。此外，PDT在保留完整器官的前提下，還可以行多次重復治療，清除剩余病變組織[10]，這樣對于病變直徑大于3 cm，累及宮頸腺腔深度超過2.5 cm的病變，更加突顯優(yōu)勢。同時，PDT治療后，女性的生育功能未受到破壞。

目前臨床中使用的光敏劑由于其成分復雜，易受生物代謝的影響，光敏損傷作用的程度不易控制，且多次使用會出現(xiàn)不良反應和耐受性[5]，因而限制了PDT治療作用的發(fā)揮。而黃芩苷具有感光效應，在加入硼砂溶液后，其光敏性明顯增強[11-12]，此外，黃芩苷具有明顯的抗腫瘤、抗炎、防止炎癌轉化以及調(diào)經(jīng)等功效[13]，對比我們前期研究的姜黃素結合PDT療法[14]，黃芩苷具有治療婦科相關病癥的藥效，在相關婦科疾病的對癥治療上，可能其結合PDT后會有優(yōu)于姜黃素的療效;黃芩苷有望成為一種高效、低毒且具有多重抗腫瘤作用的新型光敏劑。因此，本實驗擬采用黃芩苷介導PDT療法治療宮頸癌，觀察該療法對腫瘤組織的治療作用，并初步探討其可能的抑瘤機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雌性BALB/c裸鼠，4周齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學科研實驗室IVC動物房，自由進食和飲水，適應性飼養(yǎng)1周。本實驗經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：BUCM-4-2018122101-4065）。

1.1.2 細胞 宮頸癌Hela細胞，由北京協(xié)和醫(yī)學院饋贈，用含10%的胎牛血清的完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 藥物 黃芩苷（Biorule公司，美國，貨號：RB11127），姜黃素（Bioruler公司，美國，貨號：RB12712）。

1.1.4 試劑與儀器 硼砂-氫氧化鈉緩沖液0.1 mol/L pH10.1（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，貨號：BF-0091）;4%固定液（南京凱基生物技術有限公司，批號：備KGIHC016CS）;Bcl-2一抗（Abcam公司，英國，批號：ab692）;Bax一抗（CST公司，美國，批號：14796S）;RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司，批號：R0020）;蛋白磷酸酶抑制劑混合物（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1260）;脫脂奶粉（北京索萊寶科技有限公司，批號：D8340）;BSA（北京索萊寶科技有限公司，批號：A8010）;蛋白Marker（北京索萊寶科技有限公司，批號：PR1920）;PVDF膜（0.45 μm）（Millipore公司，美國，批號：IPVH00010）;ECL超敏發(fā)光液（北京索萊寶科技有限公司，批號：PE0010A+B）;30%丙烯酰胺（北京索萊寶科技有限公司，批號：0933）;TEMED（Sigma公司，美國，批號：T8133）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：PC0020）;β-tubulin（中山金橋生物有限公司，批號：TA-09）;山羊抗鼠-HRP（中山金橋生物技術有限公司：批號：134560）;山羊抗兔-HRP（中山金橋生物技術有限公司，批號：ZB-2301）;兔抗山羊-HRP（中山金橋生物技術有限公司，批號：ZB-2306）;光動力治療儀（北京鐳志威光技術有限公司，型號：BL18111611）;數(shù)顯游標卡尺（寧波得力工具有限公司，型號：DL91150）;電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-7C）;水平搖床（ORBITAL公司，美國，型號：TS-1）;pH計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠，型號：PHS-3C）;電子天平（Precisa公司，瑞士，型號：321LS）;磁力攪拌器（上海躍進醫(yī)療器械有限公司，型號：CJ-78-1A）;酶標儀（BioTek Synergy公司，美國，型號：H4）;離心機（Thermo公司，美國，型號：lablerv ls）;化學發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司，型號：Tanon-5200）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將培養(yǎng)好的宮頸癌Hela細胞調(diào)整計數(shù)為5×107/mL，在每只裸鼠的背部皮下注入100 μL細胞懸液，經(jīng)過一周潛伏期，背部出現(xiàn)近似于米粒大小的腫塊，提示宮頸癌體外移植瘤模型造模成功。待腫塊直徑大于等于0.5 cm時，將造模成功的模型鼠隨機分為4組，即：模型組、黃芩苷-PDT觀察組、PDT觀察組、姜黃素-PDT觀察組，18只/組。

1.2.2 干預方法 PDT觀察組：腫瘤周圍注射100 μL生理鹽水，6 h后瘤周注射硼砂緩沖液0.01 mol/L 100 μL后行PDT治療，照射劑量80 J/cm2（435 nm波長，0.60 A，0.54 W，距離腫瘤表面3～5 cm，照射2 min 28 s）;黃芩苷-PDT觀察組：以80 μg/mL的黃芩苷溶液100 μL代替生理鹽水，其他同PDT觀察組;姜黃素-PDT觀察組：以50 μmol/L的姜黃素溶液100 μL代替生理鹽水，其他同PDT觀察組;模型組：以自然光照代替PDT治療，其他同PDT觀察組。治療1 d后，各組處死6只取材腫瘤組織制備成病理切片，HE染色觀察組織病理學改變，另外處死6只，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測腫瘤組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達情況;剩余6只分別于治療第1、3、7、14天測量腫瘤體積，計算腫瘤體積抑制率。

1.2.3 檢測指標與方法 腫瘤體積及抑瘤率測算，利用數(shù)顯游標卡尺對腫瘤進行測量。計算各組裸鼠腫瘤體積均值并制作相關生長曲線圖：腫瘤體積V=a×b2/2（a為腫瘤的最大直徑;b為腫瘤的最短直徑）;計算觀察組抑瘤率：抑瘤率（%）=[（模型組體積-觀察組體積）/模型組體積]×100%。

HE染色進行組織病理學分析，將取材后的瘤體迅速置于4%的多聚甲醛溶液中固定12 h，經(jīng)過常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片后進行HE染色，于光鏡下觀察各組腫瘤組織不同放大倍數(shù)下的病理改變情況。

蛋白質(zhì)印跡法對凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2進行檢測，從超低溫冰箱取出腫瘤組織放于冰盒上，剪碎組織后用天平稱量30 mg左右，加入適量提前配置好的盛有裂解液的離心管中，冰上裂解30 min，于4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA測定樣品蛋白濃度，之后根據(jù)濃度測定結果加入5×Loading Buffer混合后于100 ℃處理5 min，使蛋白充分變性，分裝備用;進行SDS-PAGE凝膠電泳;然后用聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）轉膜90 min;PBS沖洗后用5%脫脂牛奶封閉2 h;用1%BSA封閉液稀釋相應的一抗（Bcl-2 1∶500稀釋;Bax 1∶1 000稀釋），使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃過夜;TBST充分洗滌PVDF膜3次，10 min/次;用封閉液稀釋HRP標記二抗（1∶5 000稀釋），37 ℃搖床孵育1 h，TBST充分洗滌PVDF膜3次，10 min/次;采用ECL超敏發(fā)光液顯影成像，拍照。用β-tubulin作為內(nèi)參同法檢測（β-tubulin1∶5 000稀釋）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗;方差不齊則采用非參數(shù)檢驗統(tǒng)計，各組間差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組宮頸癌體外移植瘤體積變化情況

2.1.1 各組移植瘤體積估算均值比較

PDT治療后，3組觀察組腫瘤體積在治療后1～3 d保持不變或略減小，3 d后體積逐漸增大;模型組腫瘤體積則呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。各觀察組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.1.2 各組抑瘤率比較

治療后1～14 d，PDT觀察組抑瘤率呈下降趨勢。黃芩苷-PDT組和姜黃素-PDT組在治療1～3 d，抑瘤率呈上升趨勢;3～14 d呈下降趨勢;黃芩苷-PDT組抑瘤率高于其他2個觀察組。治療1～3 d，黃芩苷-PDT組抑瘤效果明顯，抑瘤率上升幅度大于姜黃素-PDT組;而治療7～14 d，黃芩苷-PDT組抑瘤率雖高于其他2組，但是姜黃素-PDT組抑瘤率下降幅度小于黃芩苷-PDT組。

2.2 腫瘤的組織病理學變化

鏡下可見：觀察組腫瘤組織均小于模型組腫瘤組織，且觀察組腫瘤組織壞死面積大于模型組腫瘤組織。黃芩苷-PDT觀察組治療區(qū)域腫瘤組織壞死面積大于其余2個觀察組;且姜黃素-PDT組腫瘤組織內(nèi)有出血現(xiàn)象。鏡下4×可見模型組模型組腫瘤細胞成分相對單一，呈團巢狀排列，細胞大小不等，邊界不清，呈圓形或卵圓形，核漿比增大，染色質(zhì)粗糙，核分裂像常見，偶見壞死。與模型組比較，其余各觀察組可見壞死灶，灶內(nèi)細胞核固縮，胞質(zhì)嗜酸性變，其他腫瘤組織細胞排列較稀疏，核分裂象較模型組少見，其中以黃芩苷-PDT觀察組最為明顯，姜黃素-PDT觀察組比較明顯。見圖2～4。

2.3 凋亡相關蛋白的表達情況變化

2.3.1 Bcl-2的表達情況

治療1 d后，與模型組比較黃芩苷-PDT觀察組與PDT觀察組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;見圖5，表2。

治療14 d后，與模型組比較，其余3組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與黃芩苷-PDT觀察組比較，其余3組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與PDT觀察組比較，其余3組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;見圖6，表2。

2.3.2 各組Bax的表達比較

治療1 d后，與模型組比較黃芩苷-PDT觀察組與姜黃素-PDT觀察組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與黃芩苷-PDT觀察組比較模型組與PDT觀察組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與PDT觀察組比較黃芩苷-PDT觀察組與姜黃素-PDT觀察組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;結果見圖7，表3。

治療14 d后，與模型組比較黃芩苷-PDT觀察組與姜黃素-PDT觀察組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與黃芩苷-PDT觀察組比較其余3組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與PDT觀察組比較黃芩苷-PDT觀察組與姜黃素-PDT觀察組表達結果差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;結果見圖8，表3。

3 討論

近年來研究表明，目前臨床對于宮頸癌的主要治療手段包括手術治療、放療和化療，這些傳統(tǒng)的治療方法，給患者帶來了嚴重的身體及心理負擔，尤其對于年輕女性而言，甚至會影響其生育能力，降低患者后期生命質(zhì)量[4]。所以尋找創(chuàng)傷性小、不良反應小并且治療效果好的方法對于提高宮頸癌患者生存率和后期生命質(zhì)量至關重要，這也是臨床研究的熱點方向。

光動力療法是一種無創(chuàng)或微創(chuàng)的新型治療技術，通過在病患部位局部注射光敏劑，光敏劑經(jīng)過一段時間后特異性富集在病變組織，之后利用選定的特定波長的光源照射并激發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧，從而導致病變組織細胞發(fā)生一系列凋亡、壞死以及過度自噬等過程，最終達到治療目的[15]。因該療法具有操作簡單，對患者傷害小，治療后可保護器官結構的完整性以及可重復治療等優(yōu)勢[10]，結合宮頸本身結構的特點，該療法適用于治療宮頸癌。

黃芩苷是一種從中藥黃芩中提取出的黃酮類化合物，目前國內(nèi)外對于黃芩苷抗腫瘤作用的研究日漸深入，現(xiàn)已被證實在乳腺癌[16]、卵巢癌[17]、宮頸癌[18-19]等婦科疾病中均有療效。但關于黃芩苷聯(lián)合光動力療法的研究，國內(nèi)外鮮有報道。黃芩苷可通過促凋亡作用、抑制腫瘤血管新生、逆轉抗藥性及誘導分化等方面抑制腫瘤的生長[13]。Liang等[20]研究證實黃芩苷有廣泛的抗腫瘤作用，并且對于正常的細胞沒有明顯的不良反應。此外，在杜永峰等[11]和孟曉彩等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷有弱感光性但在加入硼砂溶液后，其感光性有所加強。據(jù)此，黃芩苷可作為一種新型的高效低毒且符合治療宮頸癌的優(yōu)質(zhì)光敏劑，將其聯(lián)合PDT來對癥治療宮頸癌具有一定的可行性。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷聯(lián)合PDT療法在治療前期能夠有效抑制腫瘤生長，其效果優(yōu)于單純PDT和姜黃素聯(lián)合PDT療法。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程較為復雜，相關研究表明，Bcl-2突變在宮頸組織發(fā)生癌變的過程中發(fā)揮了重要的作用[21]。而促/抑凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白表達與細胞凋亡密切相關。Bcl-2是一種抑制凋亡相關的蛋白，它主要通過影響線粒體凋亡途徑引發(fā)細胞凋亡，而Bax主要通過抑制Bcl-2的生物學活性從而促進凋亡[22]。

本實驗研究中發(fā)現(xiàn)，治療1 d后，各觀察組與模型組比較，Bcl-2表達均降低;Bax表達均升高。治療14 d后，PDT觀察組與姜黃素-PDT觀察組與模型組比較，Bcl-2表達降低;黃芩苷-PDT觀察組與姜黃素-PDT觀察組與模型組比較，Bax表達升高。這些結果表明黃芩苷介導的PDT療法對腫瘤可有抑制作用，且作用效果呈時間性，在治療前期黃芩苷-PDT療法治療效果優(yōu)于其余2個觀察組，但是后期效果不佳，且這種抑制作用可能是通過抑制Bcl-2的表達，促進Bax的表達，從而誘發(fā)腫瘤細胞凋亡實現(xiàn)的。

綜上所述，黃芩苷介導的PDT療法可以抑制宮頸癌腫瘤組織的生長，其機制可能與下調(diào)腫瘤組織Bcl-2的表達，增加Bax的表達從而發(fā)揮其抑瘤的作用相關，提示Bcl-2和Bax在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的作用，黃芩苷-PDT治療可以在前期通過有效抑制Bcl-2表達和促進Bax表達從而發(fā)揮抑瘤效果，但是其作用隨著時間延長而減弱，可能需要進行多次重復治療，其過程及最佳作用時效，有待后續(xù)實驗進一步深入探討、分析。

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（2020-02-01收稿 責任編輯：楊覺雄）