細(xì)菌生物膜去除效率的定量檢測(cè)

李 宇， 江 勇， 楊 琳， 謝穎瑋

3M中國(guó)有限公司, 上海 200233

細(xì)菌生物膜是粘附于載體表面，由細(xì)菌和自身分泌的胞外基質(zhì)形成的一種膜結(jié)構(gòu)，其主要成分為胞外多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，能夠極大的增強(qiáng)細(xì)菌的抗藥性和抗免疫能力等[1-3]。因此如何有效地檢測(cè)生物膜去除效率一直是生物醫(yī)學(xué)界和食品工業(yè)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[4-6]。目前，針對(duì)生物膜去除效率的評(píng)價(jià)主要通過統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)目的變化來反映[4,5]，其局限性是很明顯的，即細(xì)菌的滅殺效率并不能完全等同于生物膜的去除效率，細(xì)菌被殺死并不意味著生物膜被破壞和去除。因此開發(fā)一種新的生物膜含量的評(píng)價(jià)方法，對(duì)更直觀和科學(xué)地表征生物膜危害的防治效果將更具有實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

多糖作為生物膜的主要成分之一，對(duì)其的研究一直以來備受關(guān)注[7-9]。在一定程度上，多糖的存在也能夠作為生物膜存在的重要標(biāo)志。在本研究中，我們通過檢測(cè)消毒劑作用前后細(xì)菌生物膜中多糖含量的變化來反映生物膜的去除效率，從而為發(fā)展新的生物膜去除效率檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)(UV-VIS)；電加熱板；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；安捷倫1100 凝膠滲透色譜儀(GPC)；色譜柱(HSPgel 3.0+HSPgel 5.0)；CDC生物膜反應(yīng)器；磁力攪拌器等。

1.2 試劑

三氟乙酸；苯酚；濃硫酸；馬鈴薯淀粉；3M Avagard9250消毒劑；3M Avagard9206消毒劑等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)菌準(zhǔn)備

在無菌條件下，挑取3～5個(gè)生長(zhǎng)良好的銅綠假單孢桿菌(ATCC 15442)典型菌落放入100 mL無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)中(300 mg/L)，在(35±2) ℃振蕩過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，菌液濃度需達(dá)到108CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2生物膜培養(yǎng)

按ASTM E2562的要求搭建生物膜反應(yīng)器模型[10]。在主反應(yīng)器中加入無菌TSB(300 mg/L)培養(yǎng)液500 mL。在主反應(yīng)器中接種1 mL培養(yǎng)好的菌液，打開磁力攪拌器，使主反應(yīng)器中的培養(yǎng)體系的轉(zhuǎn)速控制在125 r/min，將生物膜反應(yīng)器放在室溫下(21±2) ℃過夜培養(yǎng)24 h。連接20 L TSB(100 mg/L)補(bǔ)液桶，以(11.7±0.2) mL/min的流速向主反應(yīng)器補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)打開主反應(yīng)器的排液管，使多余的培養(yǎng)液流出反應(yīng)器。補(bǔ)液培養(yǎng)過程持續(xù)24 h后，關(guān)閉所有反應(yīng)器，取出生長(zhǎng)好的生物膜片備用。

1.3.3消毒劑殺菌試驗(yàn)

用20 mL無菌水清洗培養(yǎng)好的生物膜片，去除殘留在表面的游離細(xì)菌。隨后將清洗好的生物膜片放入50 mL離心管中，加入4 mL消毒劑，作用3 min后，立即向50 mL離心管中加入36 mL中和劑進(jìn)行中和，充分振蕩超聲后，取菌懸液以10倍梯度稀釋進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.4水解方法及水解效率評(píng)估方法

取1片生長(zhǎng)良好的生物膜片放入20 mL生理鹽水中，充分的振蕩洗脫后制成20 mL生物膜懸液，加入4 mol/L 三氟乙酸溶液10 mL[11]，在110 ℃下加熱4 h進(jìn)行水解，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至快干，獲得樣品濃縮液。

水解效率的評(píng)估主要通過安捷倫凝膠滲透色譜儀(GPC)來進(jìn)行。對(duì)于水解前樣品，直接取1 mL樣品溶液，用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，進(jìn)行凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)試。對(duì)于水解后樣品，取1 mL樣品濃縮液，緩慢滴加三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH至7.0左右，然后同樣用0.45 μm濾膜過濾于樣品瓶中，進(jìn)行GPC測(cè)試。GPC測(cè)試條件為：流動(dòng)相為水，選用的色譜柱為HSPgel3.0 + HSPgel5.0 (6.0×150 mm)，柱溫40 ℃，流速控制為1.0 mL/min,進(jìn)樣量為2.0 μL，運(yùn)行時(shí)間為20 min。

1.3.5多糖水解后的單糖含量測(cè)定方法

分別取500 μL生物膜樣品濃縮液和馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液于4 mL樣品瓶中，加入 500 μL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚溶液，混合均勻后加入2.5 mL 濃硫酸，待溶液冷卻至室溫后，取溶液200 μL于96位孔板中，通過紫外可見分光光度計(jì)，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度[12]。結(jié)合馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到水解后的單糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌效率

使用兩種不同的消毒劑(3M Avagard9250和3M Avagard9206)進(jìn)行殺菌處理，處理前后菌液濃度的變化以及計(jì)算得到的相應(yīng)殺菌效率如表1所示。每種消毒劑重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)，兩種消毒劑的殺菌效率都達(dá)到了99%以上，呈現(xiàn)出較好的殺菌效果，如以此殺菌效率作為生物膜的去除效率，則說明生物膜已經(jīng)在很大程度上被破壞并去除。

2.2 生物膜定量檢測(cè)

2.2.1水解結(jié)果

表1 消毒劑殺菌效果表

馬鈴薯淀粉溶液水解前后的GPC譜圖如圖1和圖2所示。同時(shí)隨機(jī)選取一組生物膜樣品，其水解前后的GPC譜圖如圖3和圖4所示。可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于馬鈴薯淀粉和生物膜樣品，水解前GPC圖譜中僅有分子量大的物質(zhì)存在(保留時(shí)間短)，水解后，分子量大的化合物消失，而具有小分子量的物質(zhì)(保留時(shí)間長(zhǎng))出現(xiàn)，說明了水解過程的完全，生物膜和馬鈴薯淀粉中的多糖等大分子物質(zhì)被水解為單糖等小分子物質(zhì)，獲得了預(yù)期的水解效果，為多糖的定量分析提供了依據(jù)和可行性。

圖1 馬鈴薯淀粉溶液水解前GPC圖譜

2.2.2多糖定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取馬鈴薯淀粉對(duì)照品5 mg(精確至0.000 1g)，置10 mL容量瓶，加水溶解，稀釋至刻度。 分別移取此馬鈴薯溶液0 mL、0.4 mL、1.0 mL和2.0 mL，置10 mL樣品瓶中，用水稀釋至刻度。按照1.3.4中水解方法對(duì)馬鈴薯稀釋液進(jìn)行水解濃縮。

圖3 生物膜樣品水解前GPC圖譜

圖4 生物膜樣品水解后GPC圖譜

水解完成后，通過紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定各馬鈴薯稀釋液的吸光度, 以馬鈴薯溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖5所示，將依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)生物膜中的多糖含量進(jìn)行定量。

圖5 馬鈴薯淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3多糖含量測(cè)定結(jié)果

將生物膜樣品分成A,B 兩組，每組包含三個(gè)培養(yǎng)良好的生物膜片，每組中各選取一個(gè)生物膜片作為參考樣，分別對(duì)其進(jìn)行水解并測(cè)定其吸光度。A組其余兩個(gè)生物膜片通過3M Avagard9250消毒劑進(jìn)行殺菌，同時(shí)B組其余兩個(gè)生物膜片則通過3M Avagard9206消毒劑進(jìn)行滅菌，然后將所有消毒劑處理過的樣品分別進(jìn)行水解，測(cè)定其吸光度。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計(jì)算我們得到了兩組生物膜樣品中的多糖含量，以及消毒劑作用前后多糖含量的變化，從而更為直觀地展示了生物膜含量的變化以及據(jù)此計(jì)算得到生物膜的去除效率，結(jié)果如表2所示。通過對(duì)比傳統(tǒng)數(shù)菌方法(表1)與本研究中的方法，可以發(fā)現(xiàn)，以多糖含量的變化計(jì)算得到的生物膜去除效率遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)數(shù)菌方法，說明即使細(xì)菌被充分滅殺，生物膜依然能夠較大程度地保留。

表2 消毒劑作用前后多糖含量變化表

3 結(jié)論

本研究通過檢測(cè)消毒劑作用前后生物膜中多糖含量的變化來反映生物膜的去除效率，并與傳統(tǒng)的數(shù)菌方法進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)以細(xì)菌的滅殺效率來反映生物膜的去除效率是不完善的，生物膜作為細(xì)菌的載體，通過消毒劑很難將其徹底去除，生物膜的去除以及去除效率的檢測(cè)都需要更為有效的手段來完成。