大腹園蛛梨狀腺絲重組蛋白的表達(dá)純化與紡絲

易 拓， 朱紅年， 孟 清

東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620

天然蛛絲具有獨(dú)特的力學(xué)性能，其機(jī)械性能可與鋼絲以及凱芙拉纖維媲美；同時還具有良好的生物相容性[1]，可作為生物材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如制造血管支架[2]與人造皮膚支架[3]等。近年來還有研究發(fā)現(xiàn)蛛絲還蘊(yùn)藏著優(yōu)異的光學(xué)特性[4]，是可以用來制作超級透鏡[4]的新材料。因此，蛛絲已成為天然高分子材料研究中的“熱點”。

圓網(wǎng)蜘蛛能分泌生產(chǎn)六種不同的蛛絲纖維和一種粘膠[5]，各自有著不同的用途。由于梨狀腺絲(pyriform silk)只是附著盤(attachment discs)的一個組份，而且很難將其從蜘蛛體內(nèi)分離[6]，因此，相比于廣泛研究的拖絲(dragline)，目前鮮有關(guān)于天然梨狀腺絲的研究報道。附著盤的力學(xué)性能特點是具有極高的韌性(tougness)，韌性高達(dá)150.2～405.2 MJ/m3，但其楊氏模量僅為0.53～1.12 GPa[6]。目前為止，已經(jīng)報道了A.argentata[7]與A.ventricosus[8]PySp1的全長編碼序列還有數(shù)種其他蜘蛛的PySp1的部分編碼序列[9]。A.ventricosusPySp1編碼序列長11 931 bp，編碼3 976個氨基酸。其一級結(jié)構(gòu)包含兩端的C-terminal與N-terminal；中間的重復(fù)區(qū)段以及N-linker與C-linker，重復(fù)區(qū)氨基酸序列包含16個連續(xù)的重復(fù)單元[8]。除第16個非完全重復(fù)單元(177 aa)外，其余重復(fù)單元的氨基酸序列(213 aa)幾乎完全一致。A.argentataPySp1蛋白共有5 759個氨基酸殘基，其重復(fù)區(qū)由21個重復(fù)單元(234 aa)組成[7]。已報道的PySp1全長或部分序列分析顯示蛋白的重復(fù)區(qū)含有PXPX(X為Ala或者Arg)和QQ模塊[8]。有研究表明QQ模塊的功能可能參與梨狀腺絲蛋白在蜘蛛體內(nèi)的自組裝或者聚集[10]，以及β-片層結(jié)構(gòu)(β-Sheet)的形成[6]。PXPX模塊則被預(yù)測傾向形成無規(guī)則卷曲(random coil)[9]以賦予蛛絲彈性。

迄今，其余五種天然蛛絲的力學(xué)性能都已經(jīng)被報道，但是尚無天然梨狀腺絲的力學(xué)性能數(shù)據(jù)。因此，研究重組梨狀腺絲的力學(xué)性能可以增進(jìn)對天然梨狀腺絲的力學(xué)性能的了解?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為蛛絲的力學(xué)性能與蛛絲蛋白的重復(fù)區(qū)模塊有關(guān)[11，12]，所以在本研究中，以A.ventricosusPySp1的一個重復(fù)單元(213 aa)為基礎(chǔ)，通過無縫克隆技術(shù)獲得能夠表達(dá)含有2—3個相同重復(fù)單元的重組梨狀腺絲蛋白質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)純化獲得重組蛋白，使用濕法紡絲紡成連續(xù)的絲狀纖維。對制得的纖維進(jìn)行力學(xué)性能測試、FTIR檢測以及熱重(TG)分析等進(jìn)行表征。本實驗為后續(xù)重組梨狀腺絲的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

本實驗所用重復(fù)單元DNA片段源自本實驗室篩選得到的A.ventricosusPySp1全長編碼DNA(GeneBank: MH376748)；實驗所用細(xì)菌菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；酶以及相關(guān)試劑購自Thermal Fisher Scientific公司(美國)；實驗相關(guān)試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；表達(dá)載體由本實驗室在商用載體pET-SUMO的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造；T載體Blunt-zero購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以A.ventricosusPySp1重復(fù)單元DNA序列為模板，設(shè)計2對特異性引物(表1)。DNA片段經(jīng)BsaI 與Esp3 I酶切后產(chǎn)生的粘性末端可互補(bǔ)配對且不含有內(nèi)切酶的識別序列，可以實現(xiàn)無縫連接。5′-GCT-3′為PySp1重復(fù)單元的第一個氨基酸Ala的密碼子；5′-GTA-3′為PySp1重復(fù)單元的最后一個氨基酸Val的密碼子。在PySp1重復(fù)單元序列的5′與3′分別引入Val密碼子、Ala密碼子，以實現(xiàn)多重復(fù)單元的無縫連接(表1)，兩種密碼子均簡記為3 bp。PCR產(chǎn)物編號及對應(yīng)的引物如表2所示。PCR體系為50 μL：Q5 DNA polymerase 0.5 μL；正反向引物各2.5 μL；模板0.5 μL；5×Q5 Reaction Buffer 10 μL；2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，用ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃，30 s預(yù)變性，98 ℃，10 s變性；60 ℃，30 s 退火；72 ℃，30 s延伸；72 ℃，120 s補(bǔ)平，4 ℃保存。最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列

表2 PCR產(chǎn)物

BamHⅠ與Esp3Ⅰ酶切R-3bp；BsaⅠ與XhoⅠ酶切3bp-R；BsaⅠ與XhoⅠ酶切3bp-R-3bp；Blunt-zero、plx分別經(jīng)BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切。所有連接反應(yīng)條件為T4 DNA ligase室溫連接1小時。熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliT1。所有重組片段經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

重組DNA片段2R的構(gòu)建(圖1A)。連接R-3bp與3bp-R，得重組片段2R。Blunt-zero與2R連接得到Blunt-zero-2R，轉(zhuǎn)化E.coliT1。提取Blunt-zero-2R，經(jīng)BamHⅠ與XhoⅠ酶切Blunt-zero-2R，回收2R。plx載體與2R連接獲得表達(dá)質(zhì)粒plx-2R，轉(zhuǎn)化E.coliT1。篩選陽性克隆，過夜培養(yǎng)后再提取質(zhì)粒并測序，4 ℃保存。

重組DNA片段3R的構(gòu)建(圖1B)。連接R-3bp、3bp-R-3bp獲得重組片段2R-3bp。Blunt-zero與2R-3bp連接獲得Blunt-zero-2R-3bp。轉(zhuǎn)化E.coliT1并過夜培養(yǎng)。提取Blunt-zero-2R-3bp，BamHⅠ與XhoⅠ酶切Blunt-zero-2R-3bp，回收2R-3bp后用Esp3Ⅰ酶切，再與3bp-R連接獲得重組片段3R，最后與Blunt-zero連接獲得Blunt-zero-3R，轉(zhuǎn)化E.coliT1。過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送測序。BamHⅠ與XhoⅠ酶切Blunt-zero-3R，回收3R后與plx相連獲得表達(dá)質(zhì)粒plx-3R，轉(zhuǎn)化E.coliT1，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測序。最后用BamHⅠ與XhoⅠ酶切鑒定過渡質(zhì)粒Blunt-zero-2R、Blunt-zero3R與表達(dá)質(zhì)粒plx-2R、plx-3R。

1.3 重組蛛絲蛋白2R與3R的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將測序正確的plx-2R、plx-3R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后，涂布于含Amp(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，溫度為37 ℃。次日挑選單菌落接種至10 mL含Amp (100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床中200 r/min過夜培養(yǎng)。再以1∶100的比例將菌液接種到1 L含Amp(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG使其終濃度為0.3 mmol/L。重組蛋白2R、3R的表達(dá)條件為25 ℃，20 h。

4 000 r/min，4 ℃收集誘導(dǎo)后菌液，離心15 min。每升菌體加入50 mL的lysis buffer(20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)重懸。用高壓均質(zhì)儀(JN-3000 plus，廣州聚能生物科技有限公司)120 MPa破碎菌體，重復(fù)三次。4 000 r/min，4 ℃離心裂解液15 min，棄上清，收集沉淀。向每升菌液的沉淀中加入50 mL的wash buffer (20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，2 mol/L尿素，pH 8.0)重懸，將重懸液置于冰水浴中進(jìn)行超聲破碎(功率設(shè)定為250 W，工作5 s，間隔為8 s，重復(fù)30次，每個樣品超聲破碎1次)。4 ℃，4 000 r/min離心重懸液30 min，棄上清收集沉淀。往每升菌液的沉淀中加入50 mL dissolution buffer (20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0)，置于室溫30 min。最后4 ℃、12 000 r/min離心溶液30 min，收集上清。用透析袋(分子截留量為14 000)連續(xù)透析72 h，每隔3 h換一次透析液，透析液為超純水。透析完成后取少量樣品進(jìn)行15% SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍(lán)染色以檢測樣品純度與分子量。最后凍干蛋白。

1.4 濕法紡絲及力學(xué)性能測試

使用六氟異丙醇(HFIP)溶解凍干的蛋白粉，置于磁力攪拌器上20 r/min連續(xù)攪拌24 h制成紡絲液，其質(zhì)量體積比為10%。在開始濕紡前，于30 ℃以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心紡絲液30 min以去除不溶性雜質(zhì)。用1 mL的注射器吸取500 μL的紡絲液，LSP01-3A微量注射泵[蘭格恒流泵有限公司(上海)]以恒定流速(0.6 mL/h)將紡絲液推入凝固浴中，凝固浴為25 ℃恒溫的100%甲醇。用鑷子將凝固浴內(nèi)成型的蛛絲夾出，沿紡絲槽拉伸一段距離后再拉出液面并纏繞于線軸上，期間從低速向高速調(diào)整馬達(dá)轉(zhuǎn)速使絲纖維連續(xù)不斷地收集在線軸上，最終收集裝置的馬達(dá)轉(zhuǎn)速設(shè)定為49 r/min。所獲得的絲纖維置于通風(fēng)櫥過夜去除殘余的化學(xué)試劑。

每種纖維制備50個樣品并固定在自制紙質(zhì)框架上，用高倍率光學(xué)顯微鏡(萊卡)觀察纖維樣品，選取直徑分布均勻且表面光滑的樣品，每個樣品隨機(jī)選取三個部位測量平均直徑。用T150 universal納米拉伸儀(UTM, KLA-Tencor Inc., Oak Ridge, USA)進(jìn)行拉伸測試，測試環(huán)境為25 ℃、相對濕度為45%。測試參數(shù)設(shè)定為拉伸速率10-2s-1。力學(xué)性能的楊氏模量、最大應(yīng)力和應(yīng)變與韌性由機(jī)器自帶的軟件Nanosuit計算。用OriginPro9.1繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線。蛛絲纖維的微觀形態(tài)與表面微觀結(jié)構(gòu)由Phenom Pure desktop SEM(Phenom-world BV, Netherlands)檢測。

1.5 顯微紅外與熱重分析

使用FTIR-micro Nicoletn10MX spectrometer(Thermo Fisher Scientific有限公司)檢測纖維的二級結(jié)構(gòu)[13]，測試過程中維持恒溫(20 ℃)干燥的環(huán)境。peakFit4.12軟件對酰胺Ⅰ帶(1 600 cm-1～1 700 cm-1)的紅外光譜求二階導(dǎo)，波峰擬合算法選擇GaussAmp，baseline correction算法選擇Initial,Final lin，多次擬合使殘差值最小(r2≥0.996)。分峰處理參數(shù)設(shè)定為1 628 cm-1(β-sheet)、1 646.5 cm-1(random coil)、1 659.5 cm-1(α-helix)、1 679.5 cm-1(β-turn)和1 695 cm-1(β-sheet)[14-18]。用Origin9.1對處理后的數(shù)據(jù)繪圖。確定各子峰與各二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)的關(guān)系，并根據(jù)其積分面積計算出二級結(jié)構(gòu)的百分比含量。

熱重分析儀(TG 209 F 1 Libra，NETZSCH)測試絲纖維的熱穩(wěn)定性。測試條件為：氮?dú)獗Ｗo(hù)下，從25 ℃升溫至900 ℃，升溫速率為10 ℃/min，測試樣品質(zhì)量為5 mg。記錄的數(shù)據(jù)以Excel格式導(dǎo)出，最后用origin 9.1繪制TG、DTG圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的鑒定

使用表2中的引物組合擴(kuò)增出三種PCR產(chǎn)物：3bp-R(667 bp)、3bp-R-3bp(676 bp)與R-3bp(667 bp)。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)表明目的條帶大小與預(yù)期大小相一致。

泳道1: DNA marker,泳道2：R-3bp (667 bp), 泳道3：3bp-R-3bp(676 bp),泳道4：3bp-R (667 bp)圖2 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2 過渡質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

所有成功構(gòu)建的陽性克隆經(jīng)雙酶切、1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示。3A與3B分別為過渡質(zhì)粒Blunt-zero-2R、Blunt-zero-3R的鑒定圖；3C與3D分別為plx-2R、plx-3R的鑒定結(jié)果。將不經(jīng)雙酶切處理的質(zhì)粒設(shè)定為陰性對照，與經(jīng)過雙酶切處理的質(zhì)粒進(jìn)行電泳鑒定。電泳結(jié)果表明重組片段2R、3R成功插入Blunt-zero與plx。測序結(jié)果經(jīng)比對后，與原設(shè)計序列一致。

(A)Blunt-zero-2R雙酶切鑒定結(jié)果(B)與Blunt-zero-3R雙酶切鑒定結(jié)果(C)plx-2R雙酶切鑒定結(jié)果(D)plx-3R雙酶切鑒定結(jié)果 其中：泳道1: DNA marker、泳道2: 質(zhì)粒未經(jīng)雙酶切的陰性對照、泳道3: 質(zhì)粒雙酶切后的混合產(chǎn)物圖3 質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 重組蛛絲蛋白的表達(dá)與純化

重組蛋白2R與3R的理論分子量見表3。經(jīng)過蛋白提純、凍干等步驟后，重組蛋白2R與3R的平均產(chǎn)量為70 mg/L和66 mg/L。15% SDS-PAGE檢測重組蛋白(圖4A和圖4B)。結(jié)果顯示重組蛋白2R的相對分子量稍大于45 000；3R的相對分子量接近66 200。這種目的蛋白表觀分子量比理論分子量偏大的現(xiàn)象并不鮮見，類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他蛋白的SDS-PAGE結(jié)果中，如SUMO[19]、含正電荷氨基酸殘基的酰基載體蛋白(ACP)[20]以及其他已報道的重組梨狀腺絲蛋白[21]。造成這種現(xiàn)象的可能原因是蛋白內(nèi)的高脯氨酸含量以及SDS與蛋白的不充分結(jié)合[21]。在圖4中，誘導(dǎo)前(泳道2)與誘導(dǎo)后(泳道3)對比，表明兩種蛋白均在大腸桿菌中表達(dá)。上清(泳道4)與沉淀(泳道5)相比，表明兩種蛋白均存在于沉淀(包涵體)中，表明這兩種蛋白在大腸桿菌內(nèi)的合成速度較快，以至于不能正確折疊[22]。因此用尿素變性純化法純化蛋白。

表3 重組蛛絲蛋白的分子量

2.4 纖維2R與3R的表征

重組蛋白2R與3R溶解于HFIP后可以濕紡成連續(xù)的絲狀纖維。高倍率光學(xué)顯微鏡觀察顯示纖維2R和3R的直徑分布較均勻，纖維2R表面有不規(guī)則凸起，3R的表面較光滑，兩者的平均直徑分別為11.5 μm、14.4 μm(圖5)。

(A) 2R；(B) 3R。其中：泳道1: protein marker; 泳道2: IPTG誘導(dǎo)前細(xì)胞裂解液; 泳道3: IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞裂解液; 泳道4:細(xì)胞裂解液離心后上清; 泳道5:細(xì)胞裂解液離心后沉淀; 泳道6: 純化后的目的蛋白圖4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化檢測結(jié)果

(A)與(B) 分別為SEM圖、光學(xué)顯微鏡圖圖5 絲纖維的光學(xué)顯微鏡與掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

UTM測試結(jié)果表明(圖6與表4)，纖維2R與3R都表現(xiàn)出與天然蜘蛛絲類似的應(yīng)力-應(yīng)變行為。它們在初始階段具備抗拉伸的彈性，隨著纖維不斷地被拉伸，超過屈服點后，纖維發(fā)生了塑性變形。纖維2R與3R都具有高延展性，最大斷裂應(yīng)變分別為84%和139%，均高于天然拖絲(25%～35%[23])、次壺腹腺絲(5%)[24]、管狀腺絲(20%)[24]與葡狀腺絲(80%)[24]。與其他類型的重組梨狀腺絲纖維相比，纖維2R與3R具有更好的力學(xué)性能。比如，HPy2[21]為不含C-terminal、N-terminal的重組梨狀腺絲纖維，其包含兩個重復(fù)單元，共477個氨基酸殘基。纖維2R、3R與HPy2相比，這兩種纖維的楊氏模量與延展性均比HPy2的強(qiáng)(表4)。此外，纖維2R與3R同重組葡狀腺絲纖維相比也表現(xiàn)出了優(yōu)異的特點。W2[25]包含兩個AcSp1重復(fù)單元；W3[26]包含3個AcSp1重復(fù)單元。纖維2R與3R的楊氏模量與延展性均比W2、W3的高(表4)。這些力學(xué)能的差異一方面源自重組蛛絲蛋白結(jié)構(gòu)的差異[27]，另一方面源自紡絲條件的不同[28]。

為了獲知纖維2R與3R的二級結(jié)構(gòu)組成，因此采用FTIR分析重組纖維。測試結(jié)果表明(圖7與表5)，纖維2R與3R的二級結(jié)構(gòu)組成基本一致。纖維2R與3R的無規(guī)則卷曲(random coil)含量分別為26.57%、25.0%，均高于天然AcSp的18%、 MaSp的12%[29]、與Flag的13%～15%[30]。這可能是因為PySp1蛋白內(nèi)的(PX)nmotif傾向于形成無規(guī)則卷曲[9]。這兩種重組纖維的α-helix含量均與天然梨狀腺絲的相近[29]。

圖6 纖維2R(A)與3R(B)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線匯總圖

表4 重組蛛絲纖維機(jī)械性能匯總表

圖7 纖維2R與3R的酰胺Ⅰ區(qū)FTIR測試分峰擬合示意圖

表5 纖維2R與3R的二級結(jié)構(gòu)組成

2.5 纖維2R與3R的熱重分析

熱重分析(thermal gravity analysis，TGA)是一種分析材料熱行為(thermal behavior)的方法。不同的材料在不同的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性，表現(xiàn)為質(zhì)量不會改變、不發(fā)生氧化反應(yīng)等[31]。一旦溫度超出這個范圍，材料的微觀結(jié)構(gòu)會因高溫而崩潰。鑒于纖維2R與3R有較理想的機(jī)械性能，因此本實驗對其進(jìn)行熱行為分析。TGA結(jié)果顯示，當(dāng)溫度在200 ℃～340 ℃之間時，纖維2R、3R的質(zhì)量大幅度減少，這與之前其他種類的重組蛛絲的熱穩(wěn)定性的研究一致[32]。在100 ℃之前，這兩種纖維的質(zhì)量均降低約6%左右(圖8A)，推測是纖維中的水分或者六氟異丙醇由于高溫蒸發(fā)所致[33]。在100 ℃～200 ℃的區(qū)間內(nèi)，纖維2R與3R的質(zhì)量沒有明顯下降。當(dāng)溫度為320 ℃時，此兩種纖維的熱重?fù)p失達(dá)到最大，即這一刻纖維降解的速度最快。當(dāng)溫度高于200 ℃時，纖維2R與3R的質(zhì)量開始持續(xù)下降，原因可能是維持纖維晶體區(qū)域的氫鍵網(wǎng)格在200 ℃時已被破壞[34]，進(jìn)而開始熱分解(thermal decomposition)。以上結(jié)果表明纖維2R、3R的熱行為與多數(shù)聚合物的類似，能夠在≤200 ℃的溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定[32]。

(A)纖維2R與3R的TGA圖；(B)纖維2R與3R的DTG圖。圖8 纖維2R與3R的熱重分析圖

3 總結(jié)

本實驗以大腹圓蛛梨狀腺絲蛋白的一個重復(fù)單元為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)純化獲得了重組蛛絲蛋白2R與3R，并使用濕紡方法獲得連續(xù)的絲狀纖維。這些重組絲纖維表現(xiàn)出良好的力學(xué)性能，并具有和天然蛛絲纖維相類似的二級結(jié)構(gòu)和與一般聚合物類似的熱穩(wěn)定性。本課題拓展了對重組蛛絲纖維的研究，為后續(xù)有關(guān)重組A.ventricosusPySp1纖維的研究與應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。