貝萊斯芽孢桿菌對(duì)果蔬土傳病害的抑菌效果研究

崔文會(huì)， 炊春萌， 孫 雪， 魏 東， 李保國*， 劉 莉*

1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093; 2. 中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210

設(shè)施果蔬栽培能充分利用太陽光能，保溫保濕，提高抵抗自然災(zāi)害的能力，為反季栽培提供了保障，確保了果蔬長年供應(yīng)，滿足了市場需求。但隨著果蔬生產(chǎn)的發(fā)展，設(shè)施栽培面積不斷擴(kuò)大，連作栽培導(dǎo)致設(shè)施瓜果蔬菜的土壤鹽漬化、土傳病害日益嚴(yán)重，以及果蔬品質(zhì)差、產(chǎn)量降低，影響設(shè)施栽培經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。設(shè)施果蔬土傳病害防治可采用化學(xué)殺菌劑、培育抗病品種、間混套作、嫁接等方法，但這些防治措施各有利弊?；瘜W(xué)殺菌劑污染環(huán)境，農(nóng)藥殘留危害人畜健康；培育抗病品種的周期長，成本高；間混套作防效慢，效果滯后；嫁接防治需要大量的人力和物力且果實(shí)口感變劣。因此，開發(fā)綠色環(huán)保、高效安全的微生物制劑已成為近年來防治設(shè)施果蔬土傳病害的研究熱點(diǎn)[4,5]。

生物防治是利用活體生防菌及其代謝活性物質(zhì)來控制病害發(fā)生的一種技術(shù)，生防菌可在作物植株及根際定殖生長，形成生物屏障保護(hù)作物免受病原菌侵害，其代謝活性物質(zhì)一方面抑制殺死病原真菌，另一方面誘導(dǎo)植株提高病害抗性。另外生防菌所分解和轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)元素又可以被作物加以利用，進(jìn)而提高作物品質(zhì)、增加產(chǎn)量[6,7]。貝萊斯芽孢桿菌是2005年發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌屬的1個(gè)新種，在自然界中廣泛分布且對(duì)人畜無害、對(duì)環(huán)境無污染而且對(duì)很多病原微生物有抑制作用[8,9]。目前針對(duì)設(shè)施瓜果蔬菜土傳真菌病害的生防報(bào)道不多，本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的貝萊斯芽孢桿菌BacillusvelezensisCX-2菌株為研究對(duì)象，研究其對(duì)4種瓜果蔬菜土傳病害病原真菌的抑菌效果，并對(duì)其抑菌特性及耐鹽、促生特性進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步的田間應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株

生防菌株：貝萊斯芽孢桿菌CX-2，實(shí)驗(yàn)室前期分離自上海崇明農(nóng)田土壤。

病原真菌：番茄早疫病菌(Alternariasolani)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.)由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供；辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH值為7.0。固體培養(yǎng)基時(shí)另添加15 g/L～20 g/L瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

5%氯化鈉的固體LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 50 g/L，20 g/L瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

10%氯化鈉的固體LB培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 100 g/L，20 g/L瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基時(shí)另添加15 g/L～20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3試劑

Salkowski試劑：濃H2SO410.8 mol /L，F(xiàn)eCl34.5 mol /L。甘油、酒精、氯化鈉、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂粉均為分析純?cè)噭?，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)藥劑有限公司。

1.1.4儀器

全自動(dòng)電熱培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；分光光度計(jì)：德國BECKMAN COULTER公司；電子天平：德國Sartorius公司；高壓蒸汽滅菌器：日本三洋公司；S1000-PCR擴(kuò)增儀：美國BIO-RAD；ZWY-2102C恒溫振蕩搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；L550醫(yī)用離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1平板對(duì)峙法

抑菌活性用平板對(duì)峙法測定[10]。將4種病原菌進(jìn)行活化培養(yǎng)5 d，用打孔器在菌落邊緣區(qū)域打孔制成直徑為6 mm的病原菌菌餅，放置到PDA平板中央，同時(shí)將分離得到的單菌落點(diǎn)接在距離平板中心25 mm處，每皿接種4個(gè)菌株，以只放置病原菌菌餅的PDA平板作為對(duì)照，重復(fù)3次，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)照組中的病原菌菌絲長滿培養(yǎng)基，觀察對(duì)照組平板上是否出現(xiàn)拮抗帶，測量相對(duì)生防菌CX-2方向病原菌菌絲生長的直徑(D)和抑菌帶寬度(d)，計(jì)算抑菌率。

抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%

(1)

1.2.2無菌濾液的抑菌活性

CX-2菌株無菌濾液的制備：將菌株轉(zhuǎn)接到裝有5 mL液體LB的試管中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h，吸取3 mL菌液，移入裝有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)96 h，然后將上述發(fā)酵液10 000 r/min下離心15 min，取離心后的上清液，用孔徑為0.22 μm的細(xì)菌過濾器過濾，得到無菌濾液。

無菌濾液抑菌效果的測定：吸取100 μL無菌濾液均勻涂布于PDA平板上，然后在平板中心放置直徑為6 mm的病原菌菌餅，對(duì)照組涂布等體積的無菌水后放置相同直徑的病原菌菌餅，重復(fù)3次，5 d后觀察并記錄對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組病原菌菌餅的直徑大小，采用菌絲生長速率法計(jì)算抑菌率[11]。

1.2.3揮發(fā)性氣體的抑菌活性

采用平板倒扣法[12]測定揮發(fā)性氣體的抑菌活性，將直徑6 mm的病原菌菌餅放置在PDA培養(yǎng)基平板中央。取100 μL CX-2菌株的發(fā)酵液在LB培養(yǎng)基平板上均勻涂布，然后將兩平板對(duì)扣，封口膜密封，用100 μL無菌水替代菌株發(fā)酵液作為對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。5 d后觀察病原菌菌絲的生長情況并測量病原菌菌餅直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.4CX-2菌株的生長曲線

將已活化的菌株CX-2按3%接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL的LB液體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置一組平行和空白試驗(yàn)。30 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)30 h，每隔3 h取樣，測定培養(yǎng)液的OD600 nm值[13]，繪制生長曲線。

1.2.5CX-2菌株的耐鹽特性

將活化好的CX-2菌株分別在含鹽量為5%和10%的LB平板上劃線，將平板倒置放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h～96 h，觀察其生長情況[14]。

1.2.6CX-2菌株產(chǎn)IAA能力檢測

定性初篩：將分離純化后的菌株接種于質(zhì)量濃度為100 mg/L L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，之后將菌液10 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液加入等量Salkowski顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。以加入等體積的液體LB作為陰性對(duì)照。避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅表示能夠產(chǎn)IAA[15]。

吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制質(zhì)量濃度為10 μg/mL ～60 μg/mL，間隔為10 μg/mL的IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按照1:1體積比與Salkowski顯色劑混合，室溫避光30 min，分別在波長530 nm條件下測定其吸光度值，以蒸餾水按照1∶1體積比與Salkowski顯色劑混合液為空白對(duì)照，以IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，OD530nm值為縱坐標(biāo)繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.041 8x+0.021 9，相關(guān)系數(shù)為R2=0.932。

IAA含量測定：篩選菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后取出，10 000 r/min離心10 min，取上清液4 mL與等體積Salkowski顯色劑混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測定OD530nm值[16]。根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算菌液中IAA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CX-2菌株對(duì)4種病原真菌的抑制作用

通過平板對(duì)峙法考察CX-2菌株對(duì)4種病原真菌辣椒疫霉病菌、香蕉枯萎病菌、番茄早疫病菌、西瓜枯萎病菌的抑菌效果，結(jié)果見表1。由表1可看出，CX-2菌株對(duì)4種病原真菌的抑菌率分別為60.44%、64.40%、66.39%和62.78%，均在60%以上，說明CX-2菌株可拮抗病原真菌的生長，病原菌菌絲無法在CX-2菌株附近生長，因此在CX-2菌株周圍形成抑菌帶，從而在平板上起到抑制病原菌菌絲生長的作用。

表1 CX-2菌株對(duì)4種果蔬土傳病害病原真菌的 抑菌作用

圖1為CX-2菌株對(duì)4種病原真菌的平板對(duì)峙抑菌效果圖，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，左側(cè)未在四周點(diǎn)接生防菌CX-2的病原菌菌絲長滿整個(gè)平板，右側(cè)為點(diǎn)接生防菌CX-2后的病原菌菌絲生長平板圖，可以看到CX-2可以抑制4種病原菌的生長，在CX-2四周形成了清晰可見的抑菌帶。

A和a：辣椒疫霉病菌；B和b：香蕉枯萎病菌；C和c：番茄早疫病菌；D和d：西瓜枯萎病菌 其中A、B、C、D為對(duì)照組；a、b、c、d為實(shí)驗(yàn)組。圖1 CX-2對(duì)4種抑制效果圖

2.2 無菌濾液和揮發(fā)性氣體的抑菌活性

CX-2菌株的無菌濾液和揮發(fā)性氣體對(duì)4種病原真菌的抑菌率如表2所示，CX-2的無菌濾液具有良好的抑菌作用，對(duì)4種病原真菌的抑制率均達(dá)到了70%以上，對(duì)番茄早疫病原真菌的抑菌效果最好，為79.23%。CX-2菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，也具有抑菌作用，對(duì)香蕉枯萎病菌的抑菌效果最大，抑菌率為82.04%。從表2可知生防菌CX-2的無菌濾液和揮發(fā)性氣體中均含有可抑制病原菌生長的抑菌活性物質(zhì)，說明CX-2發(fā)揮其生防作用的途徑不止一種，其去除活菌后的無菌濾液仍然可以發(fā)揮抑菌作用，另外其揮發(fā)性氣體可以抑制病原菌的生長，說明CX-2的抑菌活性物質(zhì)中含有氣體成分。

表2 CX-2菌株的無菌濾液和揮發(fā)性氣體的 抑菌作用

2.3 CX-2菌株的生長曲線

生長曲線可以反映細(xì)菌數(shù)量、生長狀況和代謝情況，當(dāng)以獲得大量細(xì)菌個(gè)體為目的時(shí)，可以在細(xì)菌的對(duì)數(shù)期進(jìn)行操作，以獲得細(xì)菌的初級(jí)代謝產(chǎn)物為目的時(shí)，最好選擇穩(wěn)定期作為研究對(duì)象，若想獲得次級(jí)代謝產(chǎn)物，應(yīng)該選擇衰亡期，此時(shí)細(xì)菌生長環(huán)境惡化，培養(yǎng)液中的次級(jí)代謝產(chǎn)物最為豐富。圖2為CX-2菌株的生長曲線，由圖2可知，接種CX-2菌株后，0 h～6 h處于遲緩期，此時(shí)菌株生長緩慢，6 h～15 h處于對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)菌體數(shù)量明顯增多，15 h～27 h為穩(wěn)定期，菌體數(shù)不再增加，在27 h后進(jìn)入衰亡期，菌體數(shù)量開始下降。

2.4 CX-2菌株的耐鹽特性

由于種植設(shè)施果蔬的土壤多呈鹽漬化，因此需要考察CX-2菌株的耐鹽特性。利用平板點(diǎn)種法將CX-2菌株分別接種在含鹽量為5%、10%的LB平板上，圖3顯示其生長情況。由圖3可看出，該菌株可以在含鹽量為5%、10%LB平板上正常生長，具有一定的耐鹽特性，可在鹽漬化土壤中生存，因此CX-2菌株可作為開發(fā)設(shè)施果蔬生防菌劑的功能菌株。

圖2 CX-2菌株的生長曲線

圖3 CX-2菌株在含鹽平板上的生長情況

2.5 CX-2菌株產(chǎn)IAA能力

吲哚乙酸(IAA)是一種植物生長激素，它能夠促進(jìn)植物的生長，CX-2菌株產(chǎn)IAA的定性檢測結(jié)果如圖4所示，左側(cè)試管為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)試管為陰性對(duì)照組，處理后的菌株上清液經(jīng)Salkowski顯色后，菌株上清液呈現(xiàn)橙紅色，無菌培養(yǎng)基無明顯顏色變化，表明菌株具有產(chǎn)IAA能力。定量檢測CX-2菌株發(fā)酵液IAA質(zhì)量濃度為7.85 mg/L。表明CX-2菌株不僅具備抑制土壤中病原真菌的功能，還可能具備促進(jìn)植物生長的能力。

圖4 CX-2菌株產(chǎn)IAA能力定性檢測圖

3 結(jié)論

為開發(fā)設(shè)施果蔬土傳病害的生防菌，選取從土壤中分離獲得的貝萊斯芽孢桿菌CX-2菌株，采用平板對(duì)峙法和菌絲生長速率法測定其對(duì)4種果蔬土傳病害病原真菌的抑菌作用，及其無菌發(fā)酵液及揮發(fā)性氣體的抑菌效果，進(jìn)一步研究了該菌的耐鹽特性，及其產(chǎn)IAA的能力，得到如下結(jié)論：

(1) 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)證明CX-2菌株對(duì)4種果蔬土傳病害的病原真菌：辣椒疫霉病菌、香蕉枯萎病菌、番茄早疫病菌、西瓜枯萎病菌均有拮抗作用，對(duì)番茄早疫病菌發(fā)揮最大的抑菌作用，抑菌率為66.39%，對(duì)其余3種病原真菌的抑菌率也均在60%以上。

(2) CX-2菌株的無菌濾液和揮發(fā)性氣體同樣可以抑制病原真菌的生長，其中無菌濾液對(duì)4種病原真菌的抑菌率均在70%以上，揮發(fā)性氣體對(duì)香蕉枯萎病菌抑菌效果最好，抑菌率為82.04%。

(3) CX-2菌株可在含鹽量高達(dá)10%的LB平板上生長；CX-2菌株吲哚乙酸的產(chǎn)量為7.85mg/L。表明CX-2菌株可在高鹽環(huán)境下正常生長，并且可以產(chǎn)生吲哚乙酸，可能具備促進(jìn)植物生長的能力。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌BacillusvelezensisCX-2的活菌、無菌濾液和所產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體均對(duì)所選4種病原菌具有拮抗活性，具有較強(qiáng)的耐鹽和促生能力，可以用于設(shè)施果蔬土傳病害的防治，具有開發(fā)成生防菌劑的潛力。