海洋鏈霉菌HS-B34菌株抗菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

李若凡， 叢麗娜， 謝定剛， 張靖軒， 何媛媛

大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連116034

海洋微生物已經(jīng)成為農(nóng)用抗生素的新資源[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn) 50%以上新發(fā)現(xiàn)的海洋微生物活性物質(zhì)是由海洋放線菌產(chǎn)生的，許多放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護(hù)方面的用途，已廣泛用作抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤藥物。海洋鏈霉菌在低溫，高鹽，高壓和寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境中生存，這樣的特殊環(huán)境使其能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)[2-5]。許多學(xué)者從海洋環(huán)境中分離得到了多種產(chǎn)生新活性物質(zhì)的海洋放線菌，并對(duì)得到菌株的發(fā)酵條件、生物活性以及活性物質(zhì)的分離鑒定進(jìn)行了研究，取得了可喜的成果[6,7]。作者從大連海域的海參腸道中分離獲得一株海洋放線菌優(yōu)良菌株 HS-B34，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵液中活性成分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，證明該菌株對(duì)多種病原菌均具有較強(qiáng)的抑制效果，表現(xiàn)出良好的生防應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

生產(chǎn)菌株: 海洋鏈霉菌HS-B34菌株(StreptomyceHS-B34)，由大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院叢麗娜教授的實(shí)驗(yàn)室從大連海域的海參腸道中篩選得到。

供試病原菌株：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)。

1.2 培養(yǎng)基

供試病原菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

固體平板培養(yǎng)基：酵母浸粉 5 g,胰蛋白胨 10 g,氯化鈉 10 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水 1 000 mL, 調(diào)節(jié)pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：酵母浸粉 5 g,胰蛋白胨 10 g,氯化鈉 10 g,蒸餾水 1 000 mL, 調(diào)節(jié)pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(高氏一號(hào)培養(yǎng)基)：可溶性淀粉 20 g, 硝酸鉀 1 g, 硫酸亞鐵0.01 g,結(jié)晶硫酸鎂 0.5 g, 磷酸氫二鉀 0.5 g, 海水 1 000 mL, 調(diào)節(jié) pH 7.2 ～ 7.4。

優(yōu)化的鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基(本實(shí)驗(yàn)室研制)：玉米淀粉25.0 g, 蛋白胨1 g, K2HPO4·3H2O 0.3 g, MgSO4·7H2O 0.3 g和CaCO30.4 g, 海水1 000 mL, 調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4。

以上培養(yǎng)基需121 ℃，20 min滅菌后使用。

1.3 儀器與試劑

分析型高效液相色譜儀，Waters 600 controller(美國(guó) Waters 公司)；分析型色譜，YMC-Pack ODS-A(北京慧德易科技有限公司)；硅膠柱層析所用硅膠，100目～200目(青島海洋化工有限公司)；薄層層析用分析板和制備板均為GF254(安徽良臣硅源材料有限公司)；質(zhì)譜儀，LCQ-Advantage 液質(zhì)聯(lián)用(美國(guó)菲尼根質(zhì)譜公司)；高效液相色譜和ESI-MS 所用甲醇為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑為化學(xué)純或分析純。

1.4 菌株 HS-B34發(fā)酵液的制備

從-80 ℃冰箱中取出保存的海洋鏈霉菌HS-B34菌種，涂布到固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)3 d～4 d，培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出白色菌落。挑取其中一個(gè)菌態(tài)較好的單菌落，使用平板劃線法，接種到固體平板培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)3 d～4 d。挑取長(zhǎng)出的白色單菌落1～2個(gè)，接種到原始種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、220r/min的搖床培養(yǎng)2 d。將該種子液按照5% (v/v)的接種量，接種到原始發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、220 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d。測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，并離心收集發(fā)酵上清液。

1.5 抗菌活性物質(zhì)的提取及純化

以副溶血性弧菌為指示菌，采用活性追蹤的方式分離純化抗菌活性物質(zhì)。用等體積的乙酸乙酯與菌株HS-B34 發(fā)酵上清液混勻，靜置 12 h；反復(fù)萃取 2 次，合并有機(jī)相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到干燥粗提物。采用濾紙片法測(cè)定萃取物的抑菌活性，將該活性粗體物置于-4 ℃冰箱保存。

采用硅膠柱層析對(duì)活性粗提物進(jìn)行分離純化。硅膠層析柱使用濕法裝柱和濕法上樣。根據(jù)TLC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，洗脫條件采用氯仿-甲醇體系梯度洗脫，即由氯仿∶甲醇(100∶0)開始慢慢增加至氯仿：甲醇(0∶100)。由幾次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析得知，活性粗提物的第一個(gè)組分在氯仿∶甲醇(99∶0.1)時(shí)就開始沿硅膠柱向下移動(dòng)。因此，洗脫體系由氯仿∶甲醇(99∶0.1)先緩慢增加極性，之后快速增加極性。

由于該活性粗體物有顏色出現(xiàn)，當(dāng)展開劑為氯仿∶甲醇為99∶0.1時(shí)，就可以看到具有顏色的條帶沿著層析柱向下移動(dòng)，因此從第一個(gè)有顏色的條帶移動(dòng)到層析柱底時(shí)開始收集。每管收集 10 mL，采用薄層色譜法檢測(cè)每個(gè)收集管中洗脫液的組分，每種洗脫收集液經(jīng)檢測(cè)斑點(diǎn)逐漸消失，再改用下一個(gè)梯度洗脫液繼續(xù)進(jìn)行。合并相同斑點(diǎn)的洗脫液，減壓濃縮后得到各個(gè)單組分樣品。再經(jīng)測(cè)定抑菌活性，獲得具有抑菌活性的單組分，分別置于-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 抗菌活性組分的純度檢測(cè)

分離純化過(guò)程中的不同組分采用薄層層析法和高效液相色譜法檢測(cè)純度。硅膠板為 GF254 型，根據(jù)組份極性不同選用不同配比的三氯甲烷-甲醇溶液為展開劑，在紫外燈254 nm 波長(zhǎng)處顯影。

取少量已分離的組分樣品溶于甲醇中，經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，利用分析型 HPLC，以乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。色譜條件為 YMC-Pack ODS-A 分析柱(6 mm×250 mm，5 μm)，UV 檢測(cè)器，其檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm。進(jìn)樣量為 20 μL，以1 mL/min 的流速洗脫柱子50 min。

1.7 抗菌活性組分的結(jié)構(gòu)鑒定

液質(zhì)聯(lián)用色譜儀工作條件：采用 MS 柱(2.6 mm×250 mm，2 μm)進(jìn)行分析，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm，流速為 0.5 mL/min；電噴霧操作電壓 4.02 kV，操作電流 0.39 μA，毛細(xì)管溫度 275 ℃，干燥氣(N2)流速為 19.92 L/min。傅里葉紅外吸收光譜分析條件：紅外檢測(cè)儀為德國(guó)布魯克光學(xué)儀器公司(Bruker Optics INc．) VERTEX 80V傅里葉變換紅外光譜儀，光譜分辨率 ≥0.06cm-1信噪比大于30 000∶1，光譜范圍(5～50 000) cm-1。

1.8 抗菌活性組分的抑菌譜測(cè)定

利用幾種在食品和飼料工業(yè)以及海水養(yǎng)殖業(yè)中常見(jiàn)的致病菌為指示菌，包括黃曲霉(Aspergillusflavus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocusaureus)、大腸桿菌 (Eschrichiacoli)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)，采用濾紙片法[8]，各取分離后的單組分物質(zhì)10 mL，測(cè)定該組分對(duì)不同致病菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HS-B34的培養(yǎng)發(fā)酵及產(chǎn)物粗提取

將本實(shí)驗(yàn)室已分離和鑒定的海洋鏈霉菌HS-B34[9]，分別在高氏一號(hào)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)室自行篩選的培養(yǎng)鏈霉菌的優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，各取250 mL發(fā)酵液進(jìn)行離心并收集上清液，經(jīng)過(guò)乙酸乙酯萃取并旋蒸得到粗提物。使用副溶血性弧菌作為指示菌，通過(guò)牛津杯法[10]測(cè)定兩種粗提物的抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1中A和B所示。結(jié)果表明使用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)，抑菌圈直徑明顯大于高氏一號(hào)培養(yǎng)基。所以，后續(xù)的研究使用該優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行菌株HS-B34的發(fā)酵。選擇乙酸乙酯作為菌株 HS-B34 發(fā)酵液抗菌活性物質(zhì)萃取的有機(jī)溶劑，使用濾紙片法測(cè)定其萃取物的抑菌活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1中C所示。

2.2 利用硅膠柱層析分離活性粗提物

首先利用薄層色譜法(TLC)對(duì)菌株HS-B34發(fā)酵液提取物進(jìn)行分析,以TLC分析結(jié)果為指導(dǎo)分段收集硅膠柱層析上的洗脫液，將得到的各管洗脫液分別濃縮并點(diǎn)樣分析，再合并同類組分，最后得到四個(gè)組分，分別記為A1，A2，A3和A4。結(jié)果如圖2所示。利用副溶血性弧菌測(cè)試各組分抑菌活性，結(jié)果表明，組分A1的對(duì)弧菌的抑菌活性最強(qiáng)，而組分A3和A4沒(méi)有活性(圖3)。

圖1 發(fā)酵液代謝產(chǎn)物及粗提液對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果

圖2 硅膠柱組薄層層析結(jié)果

2.3 組分A1的純度檢測(cè)

從400 mg的活性粗提物中經(jīng)過(guò)硅膠柱層析分離，共獲得組分A1的質(zhì)量為86 mg，組分A2為12 mg,而且A1的抗菌活性較強(qiáng)，因此首先選擇組分A1作為后期純化以及結(jié)構(gòu)鑒定的對(duì)象。當(dāng)化合物被鑒定時(shí)，通常要求化合物達(dá)到一定的純度。本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC 檢測(cè)組分A1純度，其含量為 94.3%，說(shuō)明已達(dá)到結(jié)構(gòu)鑒定的要求(圖4)。

2.4 組分 A1 的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

采用質(zhì)譜方法對(duì)組分A1進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。根據(jù) ESI-MS(positive)譜圖(圖 5)，[M+H]+=279，[M+Na]+=301，可知物質(zhì) A1的相對(duì)分子質(zhì)量 M=278。

圖4 組分 A1 的高效液相色譜純度檢測(cè)結(jié)果

圖5 組分A1的 ESI-MS (positive )譜圖

采用傅里葉紅外吸收光譜分析組分 A1的分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖6。將該圖譜分為三個(gè)波段進(jìn)行分析，分別為 (400～1 200) cm-1， (1 200～1 900) cm-1以及(2 500 ～ 40 000) cm-1(表2)。

結(jié)合 ESI-MS譜圖，確定該化合物的分子式為C16H22O4，與文獻(xiàn)[11]的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)比可以看到：在實(shí)測(cè)紅外光譜中， 567.24 cm-1為C-C鍵彎曲振動(dòng)；705.35 cm-1和651.47 cm-1這兩個(gè)峰都為苯環(huán)的變形振動(dòng)；744.62和842.50 cm-1屬于苯環(huán)的面外振動(dòng)；942.00和962.94 cm-1屬于兩個(gè)取代苯環(huán)鏈上的C-O的伸縮振動(dòng)，其中 942.00 cm-1為C-O 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，而967 cm-1C-O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)。另外，1 039.48、1 074.61 和 1 122.28 cm-1分別為苯環(huán)的面內(nèi)對(duì)稱伸縮振動(dòng)、苯環(huán)變形振動(dòng)和苯環(huán)的面內(nèi)搖擺振動(dòng)以及靠C O雙鍵的C-O-單鍵伸縮振動(dòng)。

這些特征吸收峰與各基團(tuán)與鄰苯二甲酸二丁酯的特征吸收譜帶基本一致，一般 (400～1 333) cm-1為 C-X 單鍵伸縮振動(dòng)以及各種彎曲振動(dòng)，(650～1 000) cm-1為 Ar-H面外伸縮振動(dòng)。這個(gè)區(qū)域的理論模擬值與實(shí)際測(cè)得的紅外光譜的特征吸收峰基本一致，且基團(tuán)振動(dòng)峰位置也符合鄰苯二甲酸二丁酯的紅外理論基團(tuán)特征峰位置[11,12]，故推斷該化合物的結(jié)構(gòu)為鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)(見(jiàn)圖7)。

2.5 組分A1的抑菌圖譜

以幾種在食品和飼料工業(yè)以及海水養(yǎng)殖業(yè)中常見(jiàn)的致病菌為指示菌，采用濾紙片法，檢測(cè)所純化的

圖6 組分A1的紅外光譜譜圖

表1 紅外光譜出峰位置的解析

圖7 鄰苯二甲酸二丁酯的結(jié)構(gòu)

組分A1，即化合物鄰苯二甲酸二丁酯的抑菌圖譜(表3)?？梢钥闯觯摶衔飳?duì)這些常見(jiàn)的致病菌都有抑菌活性，且對(duì)于副溶血性弧菌的抑菌活性最為明顯。

表2 組分A1抑菌圖譜的測(cè)定

3 結(jié)論

本文以副溶血性弧菌為指示菌，采用濾紙片法進(jìn)行抗菌活性追蹤，通過(guò)乙酸乙酯萃取、硅膠吸附柱層析、制備型薄層層析和HPLC 等技術(shù)，對(duì)來(lái)自海洋的放線菌 HS-B34菌株發(fā)酵液的抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，得到2個(gè)抗菌活性組分A1和A2。進(jìn)一步對(duì)含量較高的A1組分通過(guò)液相色譜、ESI-MS和紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定該組分為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。

國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者報(bào)道植物和微生物可產(chǎn)生具有生理活性的物質(zhì)，有關(guān)從放線菌代謝產(chǎn)物中分離得到鄰苯二甲酸二丁酯及其生物活性的研究較多[12]。它是一種良好的增塑劑，主要用于聚氯乙烯的加工，使制品柔軟性良好，也是硝酸纖維素的優(yōu)良增塑劑[13]。但本研究檢測(cè)了從海洋鏈霉菌中分離到的DBP，它對(duì)多種在食品工業(yè)和海水養(yǎng)殖業(yè)中常見(jiàn)的病原菌具有廣譜的抗菌活性，尤其對(duì)副溶血性弧菌具有顯著的抑制作用。這個(gè)研究現(xiàn)象目前尚未見(jiàn)報(bào)道，有待于深入研究它對(duì)弧菌的作用機(jī)理以及在養(yǎng)殖過(guò)程中的開發(fā)利用。