子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與臨床病理特征及HPV感染的關(guān)系*

徐志紅， 鄧瑩

(1.德陽市人民醫(yī)院 生殖遺傳科， 四川 德陽 618000； 2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 中國出生缺陷監(jiān)測中心， 四川 成都 610041)

子宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌高發(fā)年齡為45～55歲，其病理類型主要分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌及腺鱗癌，其中以鱗狀細(xì)胞癌為最常見[1]。有研究顯示，子宮頸癌發(fā)病率和病死率位居我國女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌，發(fā)病率和病死率逐年上升并呈年輕化趨勢[1-2]。子宮頸癌發(fā)生及發(fā)展是一個涉及多因素、多基因及多階段的復(fù)雜過程，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染已被證實是子宮頸癌發(fā)生及發(fā)展的主要因素，子宮頸癌患者HPV感染率可高達90%[2]。除此之外，表觀遺傳學(xué)改變在子宮頸癌發(fā)病過程中也具有重要作用[3]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要分支，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、DNA構(gòu)象及穩(wěn)定性改變，在基因表達調(diào)控、基因組印跡及發(fā)育調(diào)節(jié)等方面起到重要作用[4]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secretory curl associated protein，SFRP)是細(xì)胞外因子(extracellular factor ，Wnt)信號通路的拮抗因子，可通過半胱氨酸富集區(qū)域(cysteine-rich domian，CRD)與Wnt配體結(jié)合而阻斷Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤增殖[5]。有研究顯示SFRP基因甲基化與乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤相關(guān)[6]，但其與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)性尚不清楚。因此本研究就子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與其臨床病理特征及HPV感染的關(guān)系進行探討，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院倫理會審查批準(zhǔn)，選擇2018年8月—2019年8月收治的87例子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，收集其術(shù)中切除的癌組織及配對癌旁正常組織?；颊吣挲g25～70歲、中位年齡50歲，<50歲59例、≥50歲28例，腫瘤直徑<4 cm 58例、≥4 cm 29例；FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期73例、Ⅲ～Ⅳ期14例，WHO病理分級G1級37例、G2級29例、G3級21例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌經(jīng)病理學(xué)檢查確診[1]；(2)未合并其他惡性腫瘤；(3)入院資料詳細(xì)；(4)入院前未接受任何抗癌治療；(5)所有研究對象及其家屬同意入組該實驗，并獲得書面知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并凝血系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、傳染性疾病、精神系統(tǒng)疾病、感染性疾??；(2)合并心、肝、脾、肺、腎、腦等重要臟器功能障礙；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)依從性差；(5)合并轉(zhuǎn)移性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1SFRP基因甲基化檢測 采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)法，收集子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)中切除的癌組織及配對癌旁正常組織，采用組織基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取DNA，采用DNA甲基化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)進行DNA變性及亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。以轉(zhuǎn)化后的DNA為模板，進行PCR擴增。設(shè)計SFRP基因甲基化特異引物和非甲基化特異引物，甲基化特異引物上游為5′-GGTATATTTTCGAGGGGTACG-3′，下游為5′-TTCCCGACCCGCACTCCGC-3′；SFRP基因非甲基化特異引物上游為5′-TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT-3′，下游為5′-CTTCTCTCTCCACTTCCCAACCCA-3′。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，5×PCR緩沖液10 μL，上下游引物各0.5 μL，加無核酶水補充至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性120 s，95 ℃變性60 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s，40次循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)攝像分析，如基因甲基化特異引物擴增出目的條帶則提示SFRP基因甲基化陽性，計算SFRP基因甲基化率。

1.2.2HPV感染檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，q-PCR)法，采用無菌棉簽采集子宮頸拭子，洗滌到含1 mL生理鹽水(武漢益普生物科技有限公司)的離心管中，取100 μL于離心管中，采用離心機(上海臻諾生物科技有限公司，型號ThermoFisher)10 000 r/min離心10 min，棄上清；采用DNA提取試劑盒(廣州健侖生物科技有限公司)提取沉淀細(xì)胞中的DNA，以此DNA為模板進行PCR擴增。取一支潔凈離心管，分別加入DNA 5 μL、陰性質(zhì)控品5 μL、陽性質(zhì)控品5 μL，將管蓋蓋緊，瞬時離心后進行q-PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性10 s、62 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)，根據(jù)Ct值和擴增曲線判斷結(jié)果，Ct值<38判定為HPV感染陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中SFRP基因甲基化率

結(jié)果顯示，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP基因甲基化率高于配對癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中SFRP基因甲基化率比較Tab.1 Comparison of methylation rate of SFRP gene between cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 不同臨床病理特征的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率

結(jié)果顯示，不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同WHO病理分級、FIGO分期的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率Tab.2 Comparison of methylation rate of SFRP gene among patients with different clinicopathological characteristics

2.3 HPV感染子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率

結(jié)果顯示，HPV感染陽性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率高于HPV感染陰性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同HPV感染情況的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織SFRP基因甲基化率Tab.3 Comparison of methylation rate of SFRP gene among patients with different HPV infection status

2.4 Spearman相關(guān)分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，SFRP基因甲基化率與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度無相關(guān)性(P>0.05)，與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者WHO病理分級、FIGO分期、HPV感染呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 SFRP基因甲基化率與患者臨床病理特征及HPV感染的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation between the methylation rate of SFRP gene and the clinicopathological characteristics and HPV infection

3 討論

早期子宮頸癌通常無明顯癥狀和體征，隨著病情進展，根據(jù)病灶累及范圍的大小可出現(xiàn)陰道排液、陰道流血、尿急、尿頻、便秘、下肢腫痛、腎盂積水、輸尿管梗阻、尿毒癥、貧血等繼發(fā)性癥狀[7]。目前臨床采用以手術(shù)和放射性治療為主、化學(xué)藥物治療為輔的綜合治療方案，雖然能夠改善患者臨床癥狀、控制亞臨床轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤病灶及延長生存時間，但晚期子宮頸癌治療比較困難，常因遠處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)導(dǎo)致治療失敗，預(yù)后較差[7-9]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提升子宮頸癌預(yù)后的關(guān)鍵。

HPV是一種球形DNA病毒，屬于乳多空病毒科，能引起人體皮膚或黏膜的鱗狀上皮增殖，引起人類上皮的惡性腫瘤和良性腫瘤，如尖銳濕疣、子宮頸癌、肛門癌等，近年來HPV感染受到諸多臨床工作者的廣泛關(guān)注[10-11]。據(jù)報道14～59歲人群HPV總感染率為26.8%，其感染途徑包括性傳播、密切接觸、間接接觸、醫(yī)源性感染、母嬰傳播[12]。HPV感染是引發(fā)子宮頸癌的主要生物學(xué)因素，與子宮頸癌發(fā)病過程密切相關(guān)。除此之外，表觀遺傳學(xué)改變在子宮頸癌發(fā)病過程中也具有重要作用[4]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)作用下，甲基基團與基因組中胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸(cytosine guanine dinucleotides，CpG)的胞嘧啶環(huán)第5碳原子以穩(wěn)定的共價鍵形式結(jié)合而形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)的化學(xué)修飾過程，該過程能夠在不涉及DNA序列變化的前提下改變遺傳表現(xiàn)，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、DNA構(gòu)象改變、DNA穩(wěn)定性改變、DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式改變，調(diào)控基因表達[13-15]。有研究顯示抑癌基因甲基化異常與子宮頸癌相關(guān)[16]。Wnt信號通路是一條在進化上非常保守的具有傳遞生長刺激信號功能的信號途徑，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞黏附、細(xì)胞運動、胚胎發(fā)育、中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成等方面發(fā)揮重要作用[17-19]。SFRP是Wnt信號通路的拮抗因子，可通過CRD與Wnt配體結(jié)合而阻斷Wnt信號傳導(dǎo)[20-21]。SFRP基因是一種抑癌基因，能夠抑制腫瘤增殖，其基因多態(tài)性是部分惡性腫瘤的高危因素[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞株及口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中SFRP基因有較高的甲基化率[24-25]。本研究顯示子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SFRP基因甲基化率高于配對癌旁正常組織，提示子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者存在明顯SFRP基因甲基化，可能與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，不同WHO病理分級、FIGO分期的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與WHO病理分級、FIGO分期呈正相關(guān)，提示SFRP基因甲基化與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌惡性進展有一定關(guān)系。進一步研究發(fā)現(xiàn)HPV感染陽性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化率高于HPV感染陰性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者，并且子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與HPV感染呈正相關(guān)，提示SFRP基因甲基化的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者發(fā)生HPV感染的可能性越大。

綜上所述，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者SFRP基因甲基化與患者的WHO病理分級、FIGO分期、HPV感染呈正相關(guān)，SFRP有望成為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌診斷的生物標(biāo)志物。但本研究納入病例數(shù)不足，有待進一步加大樣本量及多中心研究。