29種中藥提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性*

孫廣， 李小多， 張海龍， 唐文凱， 張?jiān)茤|**， 方文

(1.安順市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科， 貴州 安順 561000； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)在1961年首次被英國的Jecons發(fā)現(xiàn)[1]。此后，臨床上MRSA菌株的檢出率逐年增長。 MRSA 屬于葡萄球菌屬，生存營養(yǎng)要求不高，在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24 h后能夠形成黃色或淡黃色的圓形、凸起、表面光滑的菌落，菌落周圍常伴有透明溶血環(huán)[2]。MRSA 是導(dǎo)致燒傷感染、燙傷樣皮膚綜合征、術(shù)后創(chuàng)傷感染等軟組織感染的主要致病菌[3-4]，具有多重耐藥性、高感染率及高致死率等特點(diǎn)[5]，是醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌之一[6]。在美國，從2001—2010年感染MRSA的平均發(fā)病率為25.2/100 000人，且感染MRSA的發(fā)病率隨患者年齡增長而增加[7]。目前MRSA感染與乙型肝炎、獲得性免疫缺陷綜合癥(AID)成為醫(yī)療界三大最難解決的感染性疾病[8]，給臨床治療工作帶來了極大的挑戰(zhàn)，成為各國臨床抗感染的研究熱點(diǎn)。中藥是人類最早應(yīng)用的純天然藥物，具有純天然、無殘留、無抗藥性等優(yōu)勢[9]，從中藥中尋求抗MRSA的新藥物受到了不少學(xué)者的關(guān)注。貴州地處云貴高原東部，自然植被類型多樣、植物種類繁多[10]，本研究選定29種中藥進(jìn)行抑菌研究，包括貴州省產(chǎn)量高的藥材20味、已有研究顯示具有較好抑菌效果的中藥材9種，以期尋求抗MRSA的新藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1菌種來源及培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)用到的10株MRSA菌株均由安順市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科微生物室提供，標(biāo)準(zhǔn)MRSA菌株ATCC43300購于中國臨床檢驗(yàn)中心，藥敏紙片購于Oxoid Limited公司，血平板購于梅里埃生物有限公司，MH平板為杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的干粉培養(yǎng)基。

1.1.2藥材來源 本研究選用的29種中藥，其中貴州省量產(chǎn)高的中藥材20種，包括皂角、連翹、黃芩、黃柏、射干、白茅根、板藍(lán)根、穿心蓮、大青葉、金銀花、雞矢藤、蒲公英、拳參、山豆根、山慈菇、土茯苓、魚腥草、紫花地丁、苦參、龍膽草；已有文獻(xiàn)報(bào)道有較好抑菌效果的中藥材9種，包括白屈菜、返魂草、羅漢果、夏枯草、柴胡、黃芪、甘草、石榴皮、敗醬草；所有藥材均由安順市人民醫(yī)院中藥房提供。

1.1.3儀器 全自動快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，Bruker Daltonik GmbH；全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(VITEK 2 Compact)，美國bioMerieux, Inc；生物安全柜(BSC-1300IIA2)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱(IL-196HI)，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1藥物紙片的制備 中藥材60 ℃烘至恒重，粉碎，過100目篩，分別以純水和75%的乙醇為提取媒介，按料液比(g/mL)1 ∶10，常溫超聲(100 W，20 kHz)提取30 min，獲中藥提取物，濃度為100 g/L，將直徑為6 mm的無藥空白紙片放入中藥提取液(100 g/L)中浸泡24 h，取出在無菌間自然干燥，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2中藥提取液的制備 K-B紙片法篩選出的中藥經(jīng)常溫超聲(100 W，20 kHz)提取30 min、過濾，濾渣再加入10倍體積溶劑繼續(xù)常溫超聲(100 W，20 kHz)提取30 min，合并濾液，濃縮至含生藥1 000 g/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3菌株復(fù)蘇 經(jīng)微生物室BD質(zhì)譜儀鑒定菌株、全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(VITEK 2 Compact)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，最后選擇10株臨床送檢、符合實(shí)驗(yàn)要求的MRSA菌株進(jìn)行復(fù)蘇，采用頭孢西丁K-B紙片擴(kuò)散法對MRSA菌株再次判定，頭孢西丁對金黃色葡萄球菌抑菌圈≤19 mm判斷為 MRSA[11]。37 ℃培養(yǎng) 24 h，備用。

1.2.4MH平板的制備 參照MH干粉培養(yǎng)基配方：稱取MH干粉，以純水為溶劑，混勻后，放入高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min、取出，在無菌間制作直徑為90 mm的MH平板，隨機(jī)抽取10個(gè)已制作好的平板做無菌試驗(yàn)，MH平板放置4 ℃冰箱備用。

1.2.5K-B紙片法實(shí)驗(yàn) 將復(fù)蘇的10株MRSA用梅里埃比濁計(jì)調(diào)菌液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，均勻涂抹在MH平板上。5張紙片分別貼于不同菌株的MH平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑3次，取其平均值，分別比較每種中藥的水提物和75%乙醇提取物對10株MRSA菌株的平均抑菌圈直徑。用標(biāo)準(zhǔn)MRSA菌株ATCC43300作為對照菌株，用無菌生理鹽水浸泡的空白紙片作為空白對照。

1.2.6最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)實(shí)驗(yàn) 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)推薦的液體稀釋法 ，測定29種中藥提取物中藥對實(shí)驗(yàn)菌株的MIC及MBC。菌液用滅菌的肉湯培養(yǎng)基調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，在無菌96孔板中加入菌液190 μL，分別加入含生藥濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25 g/L的藥液10 μL，每種中藥重復(fù)3次；另取肉湯培養(yǎng)基190 μL加入菌液10 μL作陽性對照，取肉湯培養(yǎng)基190 μL加入無菌水10 μL作陰性對照。37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察，澄清孔為MIC；取肉眼觀察為澄清孔的液體20 μL轉(zhuǎn)至血平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，在血平板中計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者作為該藥物的MBC[12]。

1.2.7協(xié)同抗菌實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法加以改進(jìn)，用無菌的96孔板，沿X軸方向(從左到右)1～7行每孔依次加入肉湯培養(yǎng)基、1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC、2MIC的中藥醇提物各50 μL，在Y軸A-G列依次加入2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC的中藥醇取物和肉湯培養(yǎng)基各50μL(將兩藥吹打混勻)，每孔加入菌液100 μL，混勻后蓋上板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長結(jié)果。參照文獻(xiàn)[13]公式計(jì)算FIC指數(shù)。FIC指數(shù)= MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC 指數(shù)<0.5時(shí)兩藥為協(xié)同作用，0.5～1.0時(shí)兩藥為相加作用，1.0～2.0時(shí)兩藥為無關(guān)作用，>2.0時(shí)兩藥為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 篩選抗MRSA中藥

K-B紙片法篩選結(jié)果顯示，所選的29種中藥水提物對所選菌株的抑菌活性遠(yuǎn)低于醇提物，僅有黃柏的水提物有較小的抑菌圈；其中黃柏、夏枯草、甘草、苦參及黃苓的醇提物有透明的較大抑菌圈，黃柏抑菌圈最大、均值為18.1 mm；標(biāo)準(zhǔn)MRSA菌株ATCC43300的黃柏醇提物有最大抑菌圈，均值為18.5 mm，與10株臨床菌株的抑菌圈較一致；金銀花、紫花地丁的醇提物有半透明抑菌圈，說明抑菌作用不強(qiáng)，不能有效抑制細(xì)菌生長；皂角、連翹、射干、白茅根、板藍(lán)根、穿心蓮、大青葉、雞矢藤、蒲公英、拳參、山豆根、山慈菇、土茯苓、魚腥草、龍膽草、白屈菜、返魂草、羅漢果、柴胡、黃芪、石榴皮、敗醬草無抑菌圈，提示這些中藥提取物對MRSA無抑制作用。有抑菌圈的5種中藥結(jié)果見表1。

表1 K-B紙片法篩選29種中藥不同提取物對不同MRSA菌株的的抑菌效果/mmTab.1 The results of screen the traditional Chinese medicine against MRSA by K-B paper dispersion/mm

2.2 MIC和MBC

因K-B紙片法篩選29種中藥不同提取物對不同MRSA菌株的的抑菌效果基本一致，故選取標(biāo)準(zhǔn)MRSA菌株ATCC43300作為本實(shí)驗(yàn)和藥物協(xié)同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)菌株，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定。從表2可知，黃柏的MIC和MBC最小，分別為125、250 g/L，提示其抑菌作用最強(qiáng)，其次是甘草、黃苓。在最高藥物濃度為1 000 g/L范圍內(nèi)，夏枯草和苦參對MRSA 菌株無抑制，故不再作進(jìn)一步研究。

表2 5種中藥醇提物對MRSA的MIC、MBCTab.2 MIC and MBC of 5 ethanol extracts against MRSA

2.3 協(xié)同抗菌試驗(yàn)

根據(jù)公式計(jì)算得出黃柏、甘草和黃苓兩兩聯(lián)合應(yīng)用的FIC指數(shù)，結(jié)果顯示甘草與黃苓聯(lián)合應(yīng)用時(shí)FIC<0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用；黃柏與黃苓聯(lián)合應(yīng)用時(shí)FIC主要分布為1.0～2.0，表現(xiàn)為無關(guān)作用；黃柏與甘草聯(lián)合應(yīng)用時(shí) FIC主要分布為0.5～1.0，表現(xiàn)為相加作用。見表3。

表3 黃柏、甘草和黃苓兩兩聯(lián)合應(yīng)用的FIC指數(shù)Tab.3 FIC distribution of combination use of each two of Golden Cypress, Liquorice, and Radix Scutellariae

3 討論

隨著抗生素的應(yīng)用，MRSA菌株在臨床的檢出率越來越高[14]。MRSA多重耐藥嚴(yán)重，對大部分抗生素都耐藥，包括四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等同時(shí)耐藥[15]。臨床上主要應(yīng)用萬古霉素治療MRSA感染，且效果很好；但目前許多國家(包括中國)已發(fā)現(xiàn)對萬古霉素耐藥的MRSA菌株，如果不采取有效措施進(jìn)行控制，一旦MRSA對萬古霉素普遍耐藥，MRSA感染者將面臨無藥可治的危險(xiǎn)境地[16]，因此，從中藥尋求抗MRSA的新方法和新藥物的研究對臨床上MRSA的治療具有重要意義。

貴州的氣候、地形、土壤條件都特別適合木本藥材的生長，其中黃柏、吳茱萸、杜仲、厚樸及烏梅被稱為貴州傳統(tǒng)的五大木本藥材，且以質(zhì)量優(yōu)越，在國內(nèi)外享有盛譽(yù)；天麻、杜仲、黃柏、黃苓、石斛、天冬、何首烏、淫羊藿、半夏、金銀花、山慈菇、太子參等的規(guī)范化GAP種植基地已獲得國家科技部、國家中醫(yī)藥管理和省級批準(zhǔn)[17-18]。本研究選擇的29種中藥中，其中有20種是貴州省產(chǎn)量高的。目前，用臨床分離菌株來篩選傳統(tǒng)中藥對MRSA抑菌活性的報(bào)道較少見，尚未見主要以貴州省本地藥材研究MRSA感染的報(bào)道。

本研究對29種中藥的水提物和75%乙醇提取物抗MRSA作用進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，29種中藥中，水提物僅黃柏出現(xiàn)較小的抑菌圈、其余中藥的水提物對MRSA的體外抑菌活性均顯示無效。K-B法結(jié)果顯示，有7種中藥的75%乙醇提取物對MRSA出現(xiàn)明顯抑菌圈，其中黃柏、黃苓、甘草、夏枯草和苦參的抑菌圈較大且透明，說明這5種中藥對MRSA有一定的抑制作用，且75%乙醇提取物的抑菌圈均顯著大于水提物，黃柏的75%乙醇提取物對10株臨床菌株的抑菌圈均值為18.1 mm，對標(biāo)準(zhǔn)MRSA菌株ATCC43300的抑菌圈均值亦為18.5 mm；金銀花、紫花地丁的醇提物有半透明抑菌圈，說明抑菌作用不強(qiáng)，不能有效抑制細(xì)菌生長；皂角、連翹、射干、白茅根、板藍(lán)根、穿心蓮、大青葉、雞矢藤、蒲公英、拳參、山豆根、山慈菇、土茯苓、魚腥草、龍膽草、白屈菜、返魂草、羅漢果、柴胡、黃芪、石榴皮、敗醬草無抑菌圈，說明這些中藥提取物對MRSA無抑制作用，均不再進(jìn)行研究。黃柏的MIC和MBC最小，分別為125 g/L、250 g/L。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，對于MRSA抑制作用較強(qiáng)的有效成分可能為脂溶性成分，在下一步有效成分研究中應(yīng)充分考慮提取溶劑的極性。

本研究中，黃柏對于MRSA具有最強(qiáng)的抑菌活性，黃柏作為貴州傳統(tǒng)的五大木本藥材之一，在貴州省有GAP認(rèn)證的規(guī)范種植基地，且在黃柏研究中也取得一定的成果[8, 19-20]。本研究主要驗(yàn)證了黃柏的體外抑菌效果，尚未對黃柏醇提物進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體內(nèi)的抑菌效果，在下一步研究中將進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。有研究顯示服用黃柏液時(shí)偶有墜脹、藥疹、肝腎功能異常、過敏、頭痛、腹痛、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)[21]，可能與黃柏中復(fù)雜的化學(xué)成分有關(guān)，在后續(xù)的研究中，需充分考慮不良反應(yīng)的發(fā)生。協(xié)同抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甘草與黃苓聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗菌作用，F(xiàn)IC<0.5，推測可能是2種藥物的有效成分相互作用產(chǎn)生的，但其作用機(jī)制尚不清楚，仍需作進(jìn)一步研究。