煅燒骨與羧甲基殼聚糖復(fù)合材料修復(fù)家兔下頜骨缺損的成骨效果*

廖健，張霽文，程余婷，姚超，周倩，霍花，劉官娟

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 修復(fù)種植科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴陽市口腔醫(yī)院， 貴州 貴陽 550002)

牙槽骨因腫瘤、炎癥、外傷或發(fā)育不良等原因造成的骨量不足是口腔種植中的常見問題[1]，目前主要采用骨移植材料來增加牙槽骨骨量，骨移植材料來源主要有自體骨、同種異體骨、異種骨及其它人工合成骨[2]。自體骨作為骨移植材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”，移植效果最為理想[3-4]，但存在需要開辟第二術(shù)區(qū)、增加患者痛苦及感染風(fēng)險(xiǎn)的問題；而異體骨和異種骨又可能攜帶病原體或在植入后發(fā)生免疫反應(yīng)，并且處理成本相對較高，應(yīng)用受到一定限制；人工合成骨替代材料，如羥基磷灰石、高分子聚合物、膠原、磷酸鈣等，雖來源廣泛，但成本及生產(chǎn)制造要求也相對較高，并且一部分合成材料在植入后吸收率較低，較難被自身組織所替代，影響骨組織的新生改建。因此各種骨替代材料均存在不可忽視的缺點(diǎn)[6]，各種單一骨移植材料尚不能滿足廣大患者的需求[7]。理想的骨替代材料通常需具有良好的生物降解性及相容性、無免疫原性或低免疫原性、骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)作用、一定的機(jī)械強(qiáng)度、能在植入后起到支架作用并保持穩(wěn)定、利于新生組織沿其支架結(jié)構(gòu)生長、能制備成各種形狀、利于新生組織生長成所需的外形、利于細(xì)胞黏附生長的三維結(jié)構(gòu)及高孔隙率等特點(diǎn)[8-10]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)中將煅燒骨與殼聚糖復(fù)合制備得到煅燒骨/殼聚糖(CB/CS)復(fù)合材料，通過理化性能檢測表明該復(fù)合材料的主要成分為羥基磷灰石和β-磷酸三鈣，具備良好的三維結(jié)構(gòu)及高孔隙率、合適的抗壓強(qiáng)度及安全無毒[11]，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)該復(fù)合材料具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的作用[12]。本研究以前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為基礎(chǔ)，將復(fù)合材料植入家兔體內(nèi)，對植入后不同時點(diǎn)的成骨效果進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器和試劑 煅燒骨粉(calcined bone，CB)由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物材料中心提供)，Bio-oss骨粉(Geistlich，Switzerland)、羧甲基殼聚糖( carboxymethyl chitosan，CMC)由上海德默醫(yī)藥科技提供，京尼平(之信生物科技)，無水乙醇(重慶川東化工)，恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇大地自動化儀器廠)，實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾科技)，真空干燥機(jī)(日本東京理化， PDU-11003060600)顯微CT(Micro-CT，μCT 50)由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物 spf級家兔60只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，月齡2～4月，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1復(fù)合材料的制備 按照羧甲基殼聚糖與骨粉的質(zhì)量比為1 ∶1的比例，采用溶液共混的方法，以京尼平為交聯(lián)劑制備CB/CS復(fù)合材料及Bio-oss/羧甲基殼聚糖復(fù)合材料，真空干燥成型后待用。

1.2.2分組及方法 取健康成年家兔60只，隨機(jī)分為1個實(shí)驗(yàn)組和4個對照組，每組12只。各組家兔均制作骨缺損模型(如圖1)，無菌條件下選取家兔一側(cè)下頜骨作為術(shù)區(qū)，暴露下頜骨體部，鉆孔制作直徑約5 mm、深約2 mm的骨缺損區(qū)。實(shí)驗(yàn)組下頜骨缺損區(qū)植入CB/CS復(fù)合材料，4個對照組中取3組分別植入單純CB、Bio-Oss及Bio-oss/CMC復(fù)合材料，植入材料均約為0.1 g，以填滿骨缺損區(qū)為準(zhǔn)，剩余1個組為不植入任何材料的空白組。術(shù)后止血分層縫合肌層、皮下組織及皮膚，術(shù)后注射青霉素以抗感染，術(shù)后1、2 d時行術(shù)區(qū)換藥，觀察術(shù)區(qū)傷口愈合情況。分別于術(shù)第后第2、4、8及12周時每組各處死家兔3只，取出術(shù)區(qū)標(biāo)本進(jìn)行檢查。

圖1 骨缺損區(qū)的制備及植入骨移植材料Fig.1 Establishment of bone defects and implantation of bone graft material

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1肉眼觀察 觀察骨缺損區(qū)內(nèi)骨質(zhì)生長情況。

1.3.2Micro-CT掃描 將標(biāo)本置入10%甲醛溶液中，4 ℃冰箱內(nèi)固定48 h，使用Micro-CT(μCT 50)掃描，掃描電壓70 kV，電流200 μA，掃描層厚24 μm。使用SCANCO Evaluation進(jìn)行分析，取感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)骨密度(bone mineral density，BMD)、骨小梁厚度或孔壁厚度(trabecular Thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度或孔隙率(trabecular separation/spacing，Tb.Sp)及骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大體觀察

術(shù)后第2周，CB/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密，邊界尚清，質(zhì)地較硬，從表面上看材料未見明顯吸收；Bio-oss/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密、邊界尚清、質(zhì)地較硬，但表面材料有部分吸收，煅燒骨與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密、邊界尚清、質(zhì)地偏硬、表面未見骨粉吸收；Bio-oss骨粉組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密，邊界清、質(zhì)地偏硬，表面可見部分骨粉吸收；空白缺損組3只家兔的骨缺損區(qū)均未見愈合，大小相較于手術(shù)當(dāng)天略有縮小，缺損區(qū)內(nèi)可探及少量質(zhì)軟的纖維結(jié)締組織(圖2)。

術(shù)后4周，CB/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密、質(zhì)地較硬，表面可見部分材料吸收并被新生骨質(zhì)生成替代；Bio-oss/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密，質(zhì)地較硬，表面可見少量新生骨質(zhì)覆蓋；煅燒骨粉組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密、邊界尚清、質(zhì)地硬，邊緣可見少量新生骨質(zhì)生成；Bio-oss骨粉組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到材料與周圍骨質(zhì)聯(lián)結(jié)緊密，周圍新生骨質(zhì)量少，骨粉顆粒未見明顯吸收；空白組3只家兔的骨缺損區(qū)均未愈合，并被大量質(zhì)地較軟的纖維結(jié)締組織占據(jù)(圖2)。

術(shù)后第8周，CB/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到表面基本吸收，完全被新生骨質(zhì)所替代，并已形成皮質(zhì)骨；Bio-oss/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到表面仍可見植入材料存在，大量新生骨質(zhì)覆蓋，質(zhì)硬；煅燒骨組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到表面骨粉顆粒未完全吸收骨粉吸收，可見有新生骨質(zhì)生長于其上；Bio-oss骨粉組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到表面顆粒未完全吸收，有新生骨質(zhì)生產(chǎn)與植入材料表面，新生骨質(zhì)量多于術(shù)后4周時；空白組3只家兔的骨缺損區(qū)均未愈合，大量纖維結(jié)締組織占據(jù)其中(圖2)。

術(shù)后第12周，CB/CMC復(fù)合材料組3只家兔的骨缺損區(qū)均觀察到表面基本被新生骨質(zhì)所替代，骨質(zhì)連續(xù)完整；Bio-oss/CMC復(fù)合材料組3只家兔均觀察到缺損區(qū)較術(shù)后4周、8周時已明顯縮小，中央部仍見材料存留；煅燒骨組3只家兔均觀察到缺損區(qū)已明顯縮小，少量材料未吸收，大部分材料被新生骨質(zhì)替代；Bio-oss骨粉組3只家兔均觀察到缺損明顯縮小，中央處仍有骨粉材料未吸收，邊緣處骨粉材料已基本被新生骨質(zhì)替代；空白組3只家兔的骨缺損區(qū)均未見愈合，且其內(nèi)仍可探及纖維結(jié)締組織(圖2)。

圖2 各組不同時間點(diǎn)骨缺損部位觀察Fig.2 Observation of bone defect sites at different time points in each group

2.2 Micro-CT檢測

術(shù)后第2周，CB/CMC組、Bio-oss/CMC組、煅燒骨組及Bio-oss骨組缺損區(qū)內(nèi)均可見顆粒樣組織，缺損區(qū)邊界清楚。術(shù)后第4周，CB/CMC組缺損區(qū)邊緣部骨粉顆粒與周圍骨組織界限模糊，缺損區(qū)內(nèi)顆粒樣影尚存；但密度較術(shù)后第2周時明顯增加，其它對照組與術(shù)后第2周時無明顯差異。術(shù)后第8周，CB/CMC組缺損區(qū)范圍明顯縮小，僅見少量顆粒樣影存在，大部分為與周圍骨質(zhì)相同的影響；而對照組缺損區(qū)內(nèi)仍可見大量顆粒樣影，但密度較術(shù)后第4周時明顯增加，缺損區(qū)邊界也開始模糊。術(shù)后12周，CB/CMC組缺損區(qū)已基本消失，取而代之的是與周圍骨質(zhì)相同的影響；而Bio-oss/CMC組、煅燒骨組、Bio-oss骨組缺損區(qū)較術(shù)后第8周時有明顯縮小，缺損區(qū)內(nèi)也可見與周圍骨質(zhì)相同的成片狀的影響，但仍存在少量的顆粒樣影(圖3)。

圖3 各組不同時間點(diǎn)骨缺損部位Micro-CT掃描圖像Fig.3 Micro-CT scanning images of bone defect sites at different time points in each group

2.3 BMD

術(shù)后第2、4、8及12周時各組BMD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CB/CMC組在各時間段BMD值均顯著高于煅燒骨組、Bio-oss骨組及空白組，術(shù)后第2、4及12周時高于Bio-oss/CMC組。見表1。

表1 各組家兔術(shù)后第2、4、8及12周時骨缺損部位的BMD值比較Tab.1 Comparison of BMD values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

2.4 Tb.Th

術(shù)后2、4、8及12周時，各組間的Tb.Th值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CB/CMC組在各時間點(diǎn)Tb.Th值均顯著高于煅燒骨組、Bio-oss骨和空白組(P<0.05)；術(shù)后第2、8、12周時也顯著高于Bio-oss/CMC組(P<0.05)；術(shù)后第4周CB/CMC組Tb.Th值與Bio-oss/CMC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組家兔術(shù)后第2、4、8及12周時骨缺損部位的Tb.Th值比較Tab.2 Comparison of Tb.Th values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

2.5 Tb.Sp

術(shù)后第2、4、8及12周時各組Tb.Sp值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第2周CB/CMC組Tb.Sp值顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與Bio-oss/CMC組、煅燒骨組、Bio-oss骨組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后第4周CB/CMC組Tb.Sp值顯著低于其他各組，術(shù)后8周及12周CB/CMC組Tb.Sp值顯著低于Bio-oss骨組和空白組，與Bio-oss/CMC組及煅燒骨組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組家兔術(shù)后2、4、8及12周時骨缺損部位的Tb.Sp值比較Tab.3 The differences of Tb.Sp values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

2.6 Tb.N

術(shù)后第2、4、8及12周時各組間的Tb.N值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第4、8、12周時CB/CMC組Tb.N值顯著高于其他各組，術(shù)后第2周CB/CMC組Tb.N值顯著高于煅燒骨、Bio-oss骨和空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但與Bio-oss/CMC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組家兔術(shù)后第2、4、8及12周時骨缺損部位的Tb.N值比較Tab.4 Comparison of Tb.N values at 2nd, 4th, 8th and 12th weeks after surgery in each group

3 討論

測定生物材料的成骨性能，在做動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時，常選擇松質(zhì)骨作為植入部位，同時要求骨缺損的大于或等于5 mm，以避免骨缺損在不填充骨移植材料的情況下即可自行愈合[13-15]。本實(shí)驗(yàn)選擇家兔一側(cè)下頜骨體部作為植入?yún)^(qū)，制造直徑約為5 mm的骨缺損區(qū)，缺損區(qū)位于松質(zhì)骨內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)空白組未見骨缺損自行愈合，證明缺損區(qū)大小合適。從各組取出后的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來看，CB/CMC復(fù)合材料相對于對照組在引導(dǎo)成骨方面更具優(yōu)勢，CB/CMC復(fù)合材料組在12周時逐漸被新生骨組織所替代，但仍然維持支架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，未被完全吸收，保證骨組織能在其上順利生長，相較于其他組材料在引導(dǎo)骨組織生長方面更具優(yōu)勢。組織工程研發(fā)出的三維混合支架材料是將一種或者多種骨移植材料與聚合物和/或生長因子復(fù)合，從而綜合各自材料性能上的優(yōu)點(diǎn)來補(bǔ)足單一材料上的不足，以達(dá)到獲得理想的新生骨量與骨質(zhì)量[16-17]。

Micro-CT相對于臨床CT能更快的采集到三維圖像，它一般使用錐形X線束(Cone Beam)，而臨床CT使用的為扇形X線束，采用錐形X線束能得到更高的分辨率，提高射線的利用率[18]。因此在骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究中，Micro-CT因能更精確全面的測量骨結(jié)構(gòu)，并且對研究骨組織達(dá)到無創(chuàng)效果，是一種近年來被廣泛采用的評價骨的質(zhì)與量以及評測骨組織強(qiáng)度的新技術(shù)。Micro-CT革新了以往對于骨形態(tài)學(xué)的評價標(biāo)準(zhǔn)，通過直接測量骨結(jié)構(gòu)厚度，檢測骨小梁變化，描述骨3D分布，得到直觀度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)形態(tài)的計(jì)量學(xué)參數(shù)[19-21]。張亨國等[22]對植入動物體內(nèi)種植體的周圍骨界面進(jìn)行Micro-CT掃描，使用軟件分析得到一系列相關(guān)數(shù)據(jù)，通過這些分析數(shù)據(jù)能更為客觀的評價種植體與周圍骨組織的結(jié)合情況。Jae Min Song等[23]運(yùn)用Micro-CT檢測CFB-HAP與Bio-Gide膜對大鼠骨缺損愈合的影響，證實(shí)Micro-CT能有效地分析及測量新骨的形成，并能得出量化的結(jié)果。在之后的研究中，例如研發(fā)制造各類高仿生以及個性化生物材料，或是將已制造出的材料與天然組織進(jìn)行比較分析時，Micro-CT具有極高的指導(dǎo)性及使用價值，特別是在骨組織工程的研究中，Micro-CT為其研發(fā)設(shè)計(jì)提供了一種新的評價方法[24]。最為重要的是Micro-CT為骨組織工程實(shí)驗(yàn)研究提供的一個關(guān)鍵優(yōu)勢在于，骨組織再生實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可被量化[25]。Micro-CT檢測數(shù)據(jù)中Tb.N是指給定長度內(nèi)骨組織與非骨組織的交點(diǎn)數(shù)量，骨質(zhì)疏松時，Tb.N值減小。Tb.Sp是指骨小梁之間的髓腔平均寬度，Tb.Sp增加，提示骨吸收增加。在多孔材料中，Tb.Sp即可理解為孔隙率。Tb.Th是指骨小梁的平均厚度，骨質(zhì)疏松時，Tb.Th 值減小。在多孔材料中，Tb.Th 也可理解為孔壁厚度。通過檢測分析這些數(shù)據(jù)以了解骨移植材料在植入動物體內(nèi)后影響骨質(zhì)生成的具體情況。

本次實(shí)驗(yàn)，將Micro-CT掃描得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可以看出，各組BMD值均隨時間的延長而遞增，證明各組缺損區(qū)內(nèi)骨質(zhì)隨時間的增加均有所增長，而植入材料的4組的BMD值在各時期均顯著高于空白組，證明在缺損區(qū)內(nèi)植入骨移植材料后的骨愈合程度顯著強(qiáng)于自然愈合。CB/CMC復(fù)合材料組的BMD值在各時間段均顯著高于其它各組(P<0.05)，證明CB/CMC復(fù)合材料組在單位體積內(nèi)生成的骨質(zhì)量顯著多于其它各組。各組Tb.N值均隨時間延長而遞增，植入材料的4組的Tb.N值在各時期均高于空白組，證明各組缺損區(qū)內(nèi)的骨小梁數(shù)量均隨時間的增加而有所增加，且缺損區(qū)在植入骨移植材料后的骨小梁生成量顯著多于自然愈合。CB/CMC復(fù)合材料組的Tb.N值在各時間段顯著高于其它各組(P<0.05)，證明CB/CMC復(fù)合材料在植入后，在單位長度內(nèi)生成的骨小梁數(shù)量均顯著多于其它各組，有比對照組所植入材料更強(qiáng)的骨生成能力。各組Tb.Sp值均隨時間延長而遞減，植入材料的4組的Tb.Sp值在各時期均低于空白組，術(shù)后4、8、12周時，CB/CMC復(fù)合材料組的Tb.Sp值顯著低于Bio-oss骨組(P<0.05)，證明CB/CMC復(fù)合材料相較于Bio-oss骨在植入缺損區(qū)后，在單位體積內(nèi)形成的骨小梁密度更高。各組Tb.Th值均隨時間延長而遞增，植入材料的4組的Tb.N值在各時期均高于空白組，證明各組缺損區(qū)內(nèi)的骨小梁厚度均隨時間的增加而有所增加，且缺損區(qū)在植入骨移植材料后所生成的骨小梁厚度顯著高于自然愈合。CB/CMC復(fù)合材料組在各時間段的Tb.Th值均顯著高于其他各組(P<0.05)，證明缺損區(qū)植入CB/CMC復(fù)合材料后所生成骨小梁的平均厚度顯著高于其它各組。

綜上所述，CB/CMC復(fù)合材料植入缺損區(qū)后，通過其良好的孔隙率及骨引導(dǎo)、骨誘導(dǎo)作用，在相同的時間內(nèi)能生成多于對照組的骨質(zhì)，且所生成骨質(zhì)在骨小梁數(shù)目、間隙、厚度方面均優(yōu)于對照組，能更好地完成其作為骨移植材料的作用，修復(fù)骨缺損，完成骨重建，是一種理想的，且具有良好生物相容性、骨引導(dǎo)及骨誘導(dǎo)作用的骨移植材料。