mTOR非依賴途徑介導(dǎo)二甲雙胍對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠心血管損傷的作用及機(jī)制*

李培霆， 劉俊， 周海燕， 李龍*， 曾家順*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid rthritis，RA)是一種常見的以關(guān)節(jié)受累為主的慢性全身性自身免疫病，除關(guān)節(jié)外，肺、心、神經(jīng)系統(tǒng)等組織或器官也可受累，有較高的致殘及致死率[1]。近年來(lái)，RA患者體內(nèi)自身免疫介導(dǎo)的炎癥會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂、氧化應(yīng)激及高凝高血脂狀態(tài)，直接或間接參與心血管疾病發(fā)生和發(fā)展，導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和血管內(nèi)皮功能障礙[2]；除此之外，糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥等治療手段可增加動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，RA患者合并心血管損傷的發(fā)病率及死亡率較正常人明顯增高[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K/Akt )信號(hào)途徑分為依賴性和非依賴性，主要以哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)為交點(diǎn)[5]。在PI3K/Akt非依賴性途徑中，發(fā)現(xiàn)激活狀態(tài)的磷酸腺苷活化蛋白激酶(5′-adenosine monosphosphate-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及代謝，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。二甲雙胍(metformin，Met)在糖尿病及其并發(fā)癥的作用研究較多[7]，但在RA中心血管損傷的調(diào)節(jié)研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)RA大鼠模型進(jìn)行Met干預(yù)，觀察其靶向AMPK信號(hào)通路對(duì)心血管損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠32只(購(gòu)自本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量190～220 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2主要試劑及儀器 牛Ⅱ型膠原(10 mg/支，美國(guó)Chondrex公司)，弗氏不完全佐劑(5 mL/支，美國(guó)Sigma公司)，AMPK抑制劑Compound C(美國(guó)sigma公司)，0.1 mol/L冰乙酸(上海申博化工有限公司)，4%水合氯醛(天津福晨化學(xué)試劑廠)，Met(中美上海施貴寶制藥有限公司)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和mTOR抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，AMPK(武漢三鷹生物有限公司)；炎癥因子檢測(cè)試劑盒和C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，5424R離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 取8只大鼠作為正常對(duì)照組(Con組，生理鹽水灌胃)，其余24只大鼠造模：將牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L冰醋酸中，制成質(zhì)量濃度為 2 g/L溶液，與等量弗氏完全佐劑混合成穩(wěn)定乳劑(0.1 g/L)注射于大鼠尾根部0.2 mL，第14天相同方法加強(qiáng)免疫；每隔3～5 d測(cè)量足背厚度及評(píng)估關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，其中關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分定義如下[8]：踝關(guān)節(jié)正常為0分，踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹為1分，踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑或中度腫脹為3分，踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹為4分，四肢評(píng)分累計(jì)0～16分；大鼠出現(xiàn)2次反應(yīng)且關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于5分即造模成功。24只模型鼠隨機(jī)均分為模型組(RA組，生理鹽水灌胃)、Met治療組[Met組，400 mg/(kg·d) Met灌胃]、聯(lián)合治療組[Met+CC組，400 mg/(kg·d) Met灌胃+AMPK抑制劑Compound C 20 mg/(kg·d)腹腔注射]，造模后第21天起開始干預(yù)，用生理鹽水將鹽酸Met充分溶解并搖勻，制成藥水后分別對(duì)Met組、Met+CC組治療5周，同時(shí)Met+CC組大鼠予以Compound C 20 mg/(kg·d)腹腔注射，總實(shí)驗(yàn)觀察周期為8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱重后麻醉各組大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，然后暴露大鼠胸腔，剪去兩側(cè)大部分肋骨及胸骨，取心臟及胸主動(dòng)脈后予福爾馬林固定，4%甲醛浸泡，制成組織切片，顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。

1.2.2心臟及血管組織學(xué)觀察 取同一部位心臟及血管組織，4%甲醛浸泡，病理切片、HE染色，光鏡下觀察心臟及血管組織學(xué)形態(tài)，并用IPWin32系統(tǒng)采集圖像，由病理科醫(yī)師對(duì)結(jié)果評(píng)估及分析。

1.2.3血清炎癥因子γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)及IL-17含量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別取各組大鼠全血2 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清置于Ep管，按炎癥因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作程序，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠血清IFN-γ、IL-6及IL-17的熒光強(qiáng)度。

1.2.4心臟及血管組織VEGF、mTOR及AMPK蛋白表達(dá) 采用PV-6000試劑盒檢測(cè)組織抗原表達(dá)，包埋切片、脫蠟、水化、切片后孵育一抗(VEGF、AMPK及mTOR)及二抗(山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗；染色液顯色至棕黃色終止反應(yīng)，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察陽(yáng)性染色的強(qiáng)度，并用Image-pro Plus Version6.0 采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

Con組大鼠精神狀態(tài)可，毛發(fā)有光澤，行動(dòng)自如。RA組大鼠逐漸關(guān)節(jié)紅腫，進(jìn)食、活動(dòng)減少，精神萎靡，后期出現(xiàn)行走跛行、關(guān)節(jié)畸形。見圖1。

圖1 Con組與RA組大鼠不同時(shí)間前足的肉眼觀Fig.1 Observation of forefoot in Con group and RA group in different time

2.2 心臟及血管組織學(xué)變化

Con組大鼠見心臟及血管的組織結(jié)構(gòu)；RA組與Met+CC組大鼠病變相近，心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變性、壞死，可見局灶性或彌漫性的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)膜層呈現(xiàn)一定的腫脹并伴纖維排列紊亂，中層有不同程度變性如彈力組織網(wǎng)斷裂、平滑肌玻璃樣變性，外膜纖維化；Met組大鼠病變程度較RA組有所減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠心臟及血管組織學(xué)變化(HE，×400)Fig.2 Results of cardiovascular tissues in each group(HE，×400)

2.3 血清INF-γ、IL-6及IL-17水平

RA組大鼠血清INF-γ、IL-6及IL-17水平高于Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Met組大鼠血清INF-γ、IL-6水平低于RA組和Met+CC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；采用AMPK抑制劑后，Met+CC組大鼠INF-γ、IL-6及IL-17含量與RA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的血清INF-γ、IL-6及IL-17水平Tab.1 Results of serum INF-γ,IL-6 and

2.4 心血管組織VEGF、AMPKa及mTOR的表達(dá)

與Con組比較，RA組大鼠心血管組織VEGF、mTOR表達(dá)水平升高，AMPK水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與RA組、Met+CC組比較，Met組大鼠心血管組織VEGF水平降低，AMPK、mTOR升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Met+CC 組與RA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示上述變化受到AMPK抑制劑的拮抗。見表2和圖3。

圖3 各組大鼠心血管組織VEGF、AMPK及mTOR蛋白的表達(dá)(400×)Fig.3 Expression of VEGF,AMPK and mTOR protein in vascular tissue of rats in each group(400×)

表2 各組大鼠心血管組織通路相關(guān)蛋白的光密度值Tab.2 Optical density of cardiovascular tissue pathway related proteins in each

3 討論

近年來(lái)，大量研究證實(shí)炎癥因子微調(diào)控可以加速心血管損傷的進(jìn)程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA組大鼠心血管組織HE染色中心肌細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管病變的程度多于Con組，血清炎癥因

子INF-γ、IL-6及IL-17也較Con組升高(P<0.05)，提示RA處于持續(xù)炎癥狀態(tài)的同時(shí)存在早期心血管損傷。Met治療后大鼠血清炎癥因子INF-γ、IL-6降低表達(dá)減少(P<0.05)，提示Met可以減輕RA大鼠炎癥反應(yīng)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是炎癥存在的一種形式，有文獻(xiàn)報(bào)道，腹腔注射LPS可引起大鼠心臟功能障礙和心臟毒性，其機(jī)制包括AMPK/mTOR激活介導(dǎo)的抑制自噬作用，AMPK的激活改善LPS誘導(dǎo)的大鼠心臟毒性及心肌自噬上調(diào)[10]。本研究結(jié)果顯示RA組大鼠VEGF表達(dá)也較Con組升高，Met治療后表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Met可以降低RA心血管組織VEGF表達(dá)。VEGF是內(nèi)皮增殖、遷移的刺激劑，能直接促進(jìn)心肌血管的新生，增加血管通透性作用[11]。有研究表明，Met可以通過(guò)抑制人內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，從而達(dá)到抑制血管新生的作用[12]；Met作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可抑制INF和IL-6[13]；Met在糖尿病合并心血管疾病中有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制并非是控制血糖，而是降低炎癥因子和抗氧化的作用[14-15]；在人冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊標(biāo)本中VEGF呈高度表達(dá)，影響斑塊的穩(wěn)定性，且新生血管形成可促進(jìn)粥樣斑塊的病變及范圍擴(kuò)大[16]，因此Met可以抑制VEGF水平更有利于延緩斑塊。本實(shí)驗(yàn)中，與Con組相比，RA組與Met+CC大鼠心血管組織AMPK表達(dá)降低(P<0.05)，通過(guò)Met治療后AMPK蛋白、mTOR表達(dá)增加(P<0.05)，說(shuō)明Met可以調(diào)控AMPK及mTOR表達(dá)，而Compound C抑制了這些作用(P<0.05)，提示AMPK通路可能參與這一過(guò)程。mTOR信號(hào)通路包括Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路，AMPK是一種能量平衡的代謝傳感器，細(xì)胞能量的增加和AMP/ATP比值的增加能促進(jìn)AMPK的形成[17]。它通過(guò)磷酸化抑制mTOR進(jìn)而誘導(dǎo)自噬[18-19]，AMPK活化能下調(diào)mTOR活性將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖[20-21]。以往的研究證實(shí)Met是一種有效的AMPK激活劑，主要通過(guò)激活A(yù)MPK下調(diào)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORCl)表達(dá)，改變下游VEGF、Caspase3等水平，產(chǎn)生多種有益的效應(yīng)[22]；Schneider等[23]證實(shí)了AMPK可以通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵和大量導(dǎo)鈣通道來(lái)舒張阻力血管。可見，AMPK的激活在血管平滑肌亦可以產(chǎn)生保護(hù)血管的作用。然而，本實(shí)驗(yàn)中RA組大鼠存在AMPK激活時(shí)，mTOR磷酸化水平也隨之升高，與AMPK/mTOR調(diào)控通路的機(jī)制存在矛盾，推測(cè)AMPK激活時(shí)，可能還受到依賴途徑PI3K/Akt等其他信號(hào)調(diào)控mTOR表達(dá)。

綜上所述，Met對(duì)RA早期心血管損傷有保護(hù)作用，可通過(guò)減輕RA炎癥反應(yīng)及提高AMPK水平進(jìn)而調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)，從而延緩RA心血管損傷的進(jìn)展，且Met還可能通過(guò)其他途徑影響mTOR表達(dá)。