羊耳菊活性部位對(duì)PXR高表達(dá)HepG2細(xì)胞中CYP3A4蛋白表達(dá)的影響*

楊暢， 宋菲， 何俊奇， 王永林， 李勇軍， 蘭燕宇， 陳一飛， 劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.上海藥品評(píng)審核查中心， 上海 201203)

細(xì)胞色素P450酶屬于血紅素-硫醇鹽蛋白的超基因家族，可介導(dǎo)臨床約90%的藥物代謝[1-2]，其活性及表達(dá)量的變化直接影響其底物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)換[3-4]，是許多藥物發(fā)生療效改變、毒性反應(yīng)及藥物間相互作用的原因之一[5-6]。細(xì)胞色素P450 3A4酶(cytochrome P450 3A4 enzyme，CYP3A4)作為細(xì)胞色素P450酶家族中重要成員，在臨床前研究中檢測(cè)藥物對(duì)CYP3A4的誘導(dǎo)或抑制作用，已成為必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)[7]。羊耳菊[Inulacappa(Buch.-Ham. ex D. Don)DC.]又名山白芷、白牛膽和見(jiàn)消腫等，為菊科旋覆花屬植物羊耳菊的全草或根，具有消腫止痛、祛風(fēng)解熱的功效，常用于感冒發(fā)熱、風(fēng)濕疼痛、癰瘡疔毒、咽喉腫痛及乳癰等癥[8]。本課題組前期對(duì)羊耳菊藥材進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，篩選出了羊耳菊藥材發(fā)揮療效作用的活性部位[9-12]。目前以羊耳菊活性部位(main active constituents fromInulacappa, IC-MAC)為主要成份的藥物有鼻康片、雙羊喉痹通顆粒、菊黃上清含片、蓮菊感冒膠囊等制劑，臨床上應(yīng)用廣泛[13-15]，課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)IC-MAC可下調(diào)CYP3A4的比活性[16]，但機(jī)制尚不清楚。本文通過(guò)構(gòu)建可高表達(dá)CYP3A4轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)的人肝癌HepG2細(xì)胞系，研究IC-MAC對(duì)PXR的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的影響，探討IC-MAC下調(diào)CYP3A4活性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株和細(xì)菌 人肝癌HepG2細(xì)胞株(江西阿普斯戴爾生物科技有限公司)，DH5α感受態(tài)大腸桿菌(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)，質(zhì)粒pcDNA3.1-PXR由浙江大學(xué)藥學(xué)院陳樞青教授惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑 IC-MAC(自制[16])，G-418遺傳霉素硫酸鹽、氨芐西林及溶菌肉湯(luria-bertani，LB)液體培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)uGENE?6 轉(zhuǎn)染試劑(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)，4S Red Plus 核酸染色試劑盒(上海BBI生命科學(xué)有限公司)，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清、辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠(美國(guó)Thermo公司)，兔抗PXR，重組PXR蛋白和小鼠抗重組人β-肌動(dòng)蛋白(recombinant human beta-actin，β-actin；英國(guó)Abcam公司)。

1.1.3主要儀器 EL304型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)，PowerPacBasic型電泳儀、Trans-Blot Turbo型蛋白快速轉(zhuǎn)印儀及GBOXChemiXL1.4型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)，ZDP-150型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，SNAP i.d.2.0 MultiBlot Frame快速孵育儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒pcDNA3.1-PXR擴(kuò)增及提取 將質(zhì)粒pcDNA3.1-PXR轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌中，并接種于含50 mg/L氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)13 h，根據(jù)Axygen質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取，質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

圖1 pcDNA3.1-PXR質(zhì)粒圖譜Fig.1 Map of pcDNA3.1-PXR plasmid

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.3高表達(dá)PXR-HepG2細(xì)胞模型的構(gòu)建 HepG2細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)的細(xì)胞密度接種于24孔板培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%，將FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑與pcDNA3.1-PXR質(zhì)粒按2 ∶1的體積質(zhì)量比轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后加含800 mg/L G418的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以重組PXR(n=1)為對(duì)照，利用Western blot檢測(cè)PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞(n=2)中 PXR的表達(dá)水平，篩選得到高表達(dá)PXR-HepG2細(xì)胞。

1.2.4IC-MAC處理PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞 IC-MAC用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配成母液1 000×(25、50及100 g/L)，-20 ℃避光保存，加藥時(shí)用預(yù)熱至37℃的完全DMEM培養(yǎng)基稀釋至1×(25、50及100 mg/L)。將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(DMSO組，0.1%)、藥物處理組(25、50及100 mg/L IC-MAC)和陽(yáng)性藥物組[PXR激動(dòng)劑利福平(rifampin，RIF；10 μmol/L)]，分別處理24、48及72 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白備用。

1.2.5PXR和CYP3A4蛋白表達(dá) 采用Western blot檢測(cè)，制備10%的SDS-PAGE凝膠電泳的分離膠，在樣品孔中依次加入1.2.3項(xiàng)下或1.2.4項(xiàng)下各組蛋白樣品和蛋白Marker，80 V電泳20 min后再繼續(xù)以120 V電泳60 min。電泳結(jié)束后利用半干轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)移至已活化的PVDF膜上，并用SNAP快速轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行封閉和抗體孵育。BSA封閉30 min，一抗孵育(CYP3A4一抗孵育20 min，PXR一抗孵育30 min)，TBST洗滌3 min，洗滌完畢后加二抗孵育10 min；TBST洗滌3 min，于PVDF膜上加發(fā)光液1 mL，室溫反應(yīng)1 min后用凝膠成像儀器拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高表達(dá)PXR的PXR-HepG2細(xì)胞模型構(gòu)建

作為陽(yáng)性對(duì)照，重組PXR蛋白出現(xiàn)單一條帶，說(shuō)明所用抗體能正確識(shí)別PXR蛋白；PXR-HepG2細(xì)胞中的PXR蛋白表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示高表達(dá)PXR的PXR-HepG2細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見(jiàn)圖2。

注：A為PXR蛋白電泳條帶，B為PXR蛋白相對(duì)表達(dá)量；(1)與HepG2組比較，P<0.01。圖2 PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞中PXR的蛋白表達(dá)Fig.2 PXR protein expression in PXR-HepG2 and HepG2 cells

2.2 IC-MAC對(duì)PXR-HepG2細(xì)胞中CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

作為陽(yáng)性藥物，RIF在PXR-HepG2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中均能上調(diào)CYP3A4的表達(dá)，提示PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞對(duì)PXR激動(dòng)劑敏感。25、50及100 mg/L IC-MAC分別干預(yù)PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞24、48及72 h后，2種細(xì)胞中CYP3A4蛋白表達(dá)水平均較DMSO組上調(diào)，且24 h時(shí)PXR-HepG2組的上調(diào)倍數(shù)高于HepG2細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：A、B分別為IC-MAC處理后PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞中CYP3A4蛋白電泳條帶，C、D分別為IC-MAC處理后PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞中CYP3A4蛋白相對(duì)表達(dá)量；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 IC-MAC處理后PXR-HepG2和HepG2細(xì)胞中CYP3A4的蛋白表達(dá)Fig.3 CYP3A4 protein expression in PXR-HepG2 and HepG2 cells after treatment with IC-MAC

3 討論

PXR是核受體超家族的成員，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能[17-18]。當(dāng)PXR與配體結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生改變，與視黃醛X受體形成異二聚體，同時(shí)招募輔活化因子或輔阻遏物形成復(fù)合物，然后結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子上的順式作用元件，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。自2000年Moore等[20]發(fā)現(xiàn)圣約翰草能激活PXR、誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)后，PXR逐漸成為研究P450酶表達(dá)調(diào)控的熱點(diǎn)靶蛋白。PXR調(diào)控的基因非常廣泛，包括Ⅰ相代謝酶、Ⅱ相代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[17-18]。研究表明，PXR是CYP3A4的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[21-22]。

HepG2是一種永生化人肝癌細(xì)胞系，目前作為常用的體外細(xì)胞模型被廣泛用于CYP3A4的相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)中[23-24]。HepG2細(xì)胞雖具有較完整的Ⅰ相代謝酶表達(dá)，但PXR和CYP3A4的表達(dá)水平不高，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)外源性PXR的高表達(dá)可以達(dá)到考察PXR功能的目的[25]。因此，本文選用HepG2細(xì)胞作為PXR高表達(dá)的體外轉(zhuǎn)基因模型的載體，考察IC-MAC是否通過(guò)PXR途徑來(lái)調(diào)節(jié)CYP3A4的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，構(gòu)建的PXR-HepG2細(xì)胞模型能高表達(dá)PXR，且PXR激動(dòng)劑RIF能誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)，表明體外細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

在此基礎(chǔ)上，本研究分別用不同濃度的IC-MAC處理PXR-HepG2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，與陰性對(duì)照組相比，IC-MAC均能誘導(dǎo)2種細(xì)胞中CYP3A4的表達(dá)；經(jīng)IC-MAC處理24 h后，相較于48和72 h，PXR-HepG2細(xì)胞中CYP3A4表達(dá)上調(diào)幅度最高；在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的條件下，外源基因的表達(dá)會(huì)隨著時(shí)間的推移逐漸降低；在24 h時(shí)，PXR-HepG2細(xì)胞中PXR的表達(dá)量可能達(dá)到最高值，然后逐漸下降，其對(duì)CYP3A4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力也隨之變化。所以IC-MAC處理后，PXR-HepG2細(xì)胞中CYP3A4表達(dá)水平在24 h的上調(diào)幅度最大。在24 h時(shí)，與HepG2細(xì)胞相比，PXR-HepG2細(xì)胞中CYP3A4表達(dá)水平上調(diào)幅度明顯更大，說(shuō)明IC-MAC可能通過(guò)PXR來(lái)上調(diào)CYP3A4的表達(dá)。

課題組前期曾利用Cocktail 探針?biāo)幬锓疾霫C-MAC對(duì)大鼠細(xì)胞色素P450 主要亞型酶(CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1)比活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC-MAC可抑制CYP3A4的比活性[16]，但是本研究卻發(fā)現(xiàn)IC-MAC可通激活PXR促進(jìn)CYP3A4的表達(dá)。影響酶比活性的途徑通常有2種，一是改變酶活性，二是通過(guò)改變酶的表達(dá)來(lái)增加或減少單位蛋白內(nèi)的酶含量[26]。本文研究IC-MAC對(duì)PXR的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的影響，主要是從酶表達(dá)調(diào)控的角度來(lái)研究IC-MAC下調(diào)CYP3A4活性的機(jī)制。因此，PXR被激活后，首先是上調(diào)CYP3A4 mRNA表達(dá)，進(jìn)而增加其蛋白表達(dá)。有研究表明，蛋白翻譯后修飾可能會(huì)導(dǎo)致P450酶mRNA，蛋白表達(dá)和活性不一致的現(xiàn)象[27]。因此，可推測(cè)IC-MAC 對(duì)CYP3A4表達(dá)及活性的影響是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可能涉及到蛋白翻譯后修飾。在下一步的研究中，將從導(dǎo)致蛋白降解的泛素化修飾入手，以期解釋IC-MAC處理后CYP3A4表達(dá)和活性不一致的問(wèn)題。