CYP450蛋白在HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞中的表達(dá)差異*

李靖， 彭仕林， 劉亭， 李勇軍， 王永林， 王愛民**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004)

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)主要分布在肝臟中，參與絕大多數(shù)藥物的Ⅰ相代謝，在藥物代謝過程中具有重要意義[1-4]。肝臟藥物代謝研究是藥物開發(fā)中不可缺少的一個環(huán)節(jié)，但是由于體內(nèi)研究的復(fù)雜性，研究人員往往選擇體外肝細(xì)胞模型開展藥物代謝機(jī)制研究[5-6]。目前采用的細(xì)胞模型主要有小鼠原代肝細(xì)胞、肝細(xì)胞系等。小鼠原代肝細(xì)胞來源于小鼠肝組織，其肝臟藥物代謝酶的表達(dá)情況最接近于機(jī)體，被廣泛應(yīng)用于藥物代謝途徑、代謝效率、藥物代謝酶的抑制和誘導(dǎo)等方面的研究[7-8]。HepG2細(xì)胞來源于肝細(xì)胞，是一種表型與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，保留了肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性[9-10]。細(xì)胞模型的選擇在體外代謝實(shí)驗(yàn)中及其重要，且細(xì)胞中CYP450表達(dá)豐度直接影響到相關(guān)研究的科學(xué)性，故本研究旨在分析HepG2細(xì)胞和小鼠原代肝細(xì)胞中CYP450蛋白表達(dá)的差異，為合理選擇CYP450代謝模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 6只SPF級昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK (黔) 2012-0001。飼養(yǎng)于濕度40%～70%，溫度20～25 ℃的環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。HepG2細(xì)胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑 BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)、Percoll(索萊寶生物科技有限公司)、CYP3A4抗體(Abcam公司)、CYP1A2抗體(Abcam公司)、CYP2D6抗體(CST公司)、CYP2C19抗體(Abcam公司)、CYP2E1抗體(Abcam公司)、CYP2C9抗體[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、β-actin抗體(Abcam公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔Ig G(Invitrogen公司)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠Ig G(Invitrogen公司)。

1.1.3儀器 DH6000BII型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)、TS-100F熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、Thermo fresco 17低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)、電泳儀(美國伯樂生物公司)、蛋白快速轉(zhuǎn)印儀(美國伯樂生物公司)、凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分離小鼠原代肝細(xì)胞 采用改良的兩步灌流法分離小鼠原代肝細(xì)胞[11-13]：取禁食12 h后的SPF級昆明種小鼠，用10%水合氯醛麻醉；暴露肝臟，用平口鑷將腹部臟器向右外側(cè)牽拉，暴露并識別肝門靜脈與下腔靜脈；用留置針刺穿肝門靜脈，使用37 ℃溫浴的前灌流液進(jìn)行第一次灌注，灌注體積為24 mL/只，灌流液從肝門靜脈進(jìn)入、從下腔靜脈流出；肝臟完全變?yōu)橥咙S色后，隨即換成已溫浴至37 ℃且含有Ⅳ型膠原酶的后灌流液進(jìn)行灌注，灌注體積為40 mL/只，灌流方向同第一次灌注。用手術(shù)剪剪下肝臟，使用無血清培養(yǎng)基清洗2次；在新的無血清培養(yǎng)基中使用細(xì)胞刮刀碾碎肝臟，即得肝組織懸液；使用200目篩網(wǎng)過濾肝組織懸液，取濾液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，533 r/min離心3 min，棄上清，加入新的無血清培養(yǎng)基混勻離心，重復(fù)3次；取沉淀，按照Percoll細(xì)胞分離液說明書，加入適量無血清培養(yǎng)基、10×PBS與Percoll細(xì)胞分離液后，混勻、1 012 r/min離心7 min，棄上清，即得小鼠原代肝細(xì)胞。

1.2.2小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng) 向獲得的小鼠原代肝細(xì)胞沉淀中加入DMEM培養(yǎng)基10 mL(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素)重懸、混勻，按密度4.5×108個/L接種于預(yù)包被有鼠尾膠原的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基體積為5 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，加入1×PBS 2 mL洗滌；再加入新的DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)。

1.2.3HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4蛋白提取 小鼠原代細(xì)胞培養(yǎng)36 h、HepG2細(xì)胞長至對數(shù)生長期時，棄培養(yǎng)基并加入1×PBS 2 mL洗滌2次。按400 μL/個培養(yǎng)瓶加入RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，在冰上搖晃至細(xì)胞全部脫落，收集細(xì)胞懸液至1.5 mL離心管中，渦混10 s后置于冰上裂解5～10 min，重復(fù)3～5次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；收集上清液；用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.5Western blot檢測CYP450蛋白表達(dá) 取12 μg總蛋白，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，使用半干轉(zhuǎn)系統(tǒng)25 V、1.0 A轉(zhuǎn)膜30 min，轉(zhuǎn)膜后用5% BSA于4 ℃封閉4 h。按β-actin抗體1 ∶5 000、CYP2E1抗體1 ∶5 000、CYP2D6抗體1 ∶1 000、CYP2C9抗體1 ∶500、CYP2C19抗體1 ∶2 000、CYP3A4抗體1 ∶2 000、CYP1A2抗體1 ∶2 000的比例，于4 ℃孵育12 h；用1×TBST洗膜5次后，加入相應(yīng)的二抗(1 ∶2 000)，于4 ℃下孵育1.5 h；1×TBST洗膜5次后，加入ECL Plus化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，使用Quantity one軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，計算目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞形態(tài)

分離小鼠原代肝細(xì)胞后，分別于4、6及24 h在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，如圖1所示，細(xì)胞生長至4 h時，呈圓形；細(xì)胞生長至6 h時，呈圓形，較多細(xì)胞可見雙核；當(dāng)細(xì)胞生長至24 h時，細(xì)胞具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)，可見雙核，呈多邊形，且細(xì)胞相互接觸，排列成肝索樣結(jié)構(gòu)。

4 h 6 h 24 h圖1 小鼠原代肝細(xì)胞形態(tài) (100×)Fig.1 Morphology of mouse primary hepatocytes (100×)

2.2 CYP2E1及CYP2C19蛋白表達(dá)

HepG2細(xì)胞中未檢測到CYP2E1及CYP2C19蛋白表達(dá)；小鼠原代肝細(xì)胞中CYP2E1/β-actin為1.238±0.045、CYP2C19/β-actin為1.262±0.195，CYP2E1及CYP2C19蛋白表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與HepG2細(xì)胞比較，P<0.01。圖2 HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞中CYP2E1及CYP2C19蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression levels of CYP2E1 and CYP2C19 in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes

2.3 CYP2C9及CYP2D6蛋白表達(dá)

如圖3所示，小鼠原代肝細(xì)胞中CYP2C9/β-actin為1.209±0.022，CYP2D6/β-actin為2.162±0.138；而HepG2細(xì)胞中CYP2C9/β-actin、CYP2D6/β-actin分別為0.154±0.029、0.781±0.077。小鼠原代肝細(xì)胞中CYP2C9的表達(dá)量約為HepG2細(xì)胞的7.9倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；小鼠原代肝細(xì)胞中CYP2D6的表達(dá)量約為HepG2細(xì)胞的2.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：(1)與HepG2細(xì)胞比較，P<0.01。圖3 HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞中CYP2C9及CYP2D6蛋白表達(dá)Fig.3 The protein expression levels of CYP2C9 and CYP2D6 in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes

2.4 CYP3A4及CYP1A2蛋白表達(dá)

小鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A4/β-actin、CYP1A2/β-actin分別為1.382±0.092及1.088±0.070，HepG2細(xì)胞中CYP3A4/β-actin為0.077±0.018、CYP1A2/β-actin為0.101±0.007。小鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A4的表達(dá)量約為HepG2細(xì)胞的17.9倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；小鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2的表達(dá)量約為HepG2細(xì)胞的10.7倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：(1)與HepG2細(xì)胞比較，P<0.01。圖4 HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞中CYP3A4及CYP1A2蛋白表達(dá)Fig.4 The protein expression levels of CYP3A4 and CYP1A2 in HepG2 cells and mouse primary hepatocytes

3 討論

細(xì)胞模型具有操作簡便、易獲得、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在藥物的ADMET研究中得到廣泛應(yīng)用[14]。動物原代肝細(xì)胞、人肝細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞是目前使用較多的肝細(xì)胞模型[15-16]。評估藥物代謝和毒性的體外模型的黃金標(biāo)準(zhǔn)是新鮮分離的人原代肝細(xì)胞，但其價格昂貴且不易獲得[17-18]。因此動物原代肝細(xì)胞，尤其是小鼠原代肝細(xì)胞，逐漸成為藥物ADMET研究的首選。除了原代肝細(xì)胞，肝癌細(xì)胞系如HepG2由于其容易獲取，價格低廉，也是目前常用的藥物ADMET模型[19-22]。而CYP450酶在藥物代謝中發(fā)揮重要作用[1]，故本實(shí)驗(yàn)研究HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞的CYP450蛋白表達(dá)差異。

本研究結(jié)果表明，在HepG2細(xì)胞中檢測不到CYP2E1、CYP2C19的蛋白表達(dá)，且其CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2的表達(dá)也明顯較低。這一結(jié)果與其mRNA水平研究結(jié)果一致[23-24]。由此推測，當(dāng)使用該細(xì)胞模型研究由CYP2E1、CYP2C19代謝的藥物時，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會與實(shí)際情況有所偏差。若必須使用HepG2細(xì)胞研究由CYP2E1、CYP2C19代謝的藥物，則須先建立CYP2E1、CYP2C19穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系再進(jìn)行相應(yīng)研究，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而小鼠原代肝細(xì)胞中，CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2都有較高表達(dá)，且CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2的表達(dá)量遠(yuǎn)高于HepG2細(xì)胞(P<0.01)?？芍苯佑糜谘芯拷?jīng)CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、CYP1A2代謝的相關(guān)藥物。則當(dāng)使用HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞對同一種藥物進(jìn)行代謝或毒性研究時，小鼠原代肝細(xì)胞和HepG2細(xì)胞可能表現(xiàn)截然不同，藥物的毒性或藥效可能會被誤判。這提醒研究人員應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)對象的特點(diǎn)，如是否需要CYP450激活，來合理選擇細(xì)胞模型。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功研究了CYP450蛋白在HepG2細(xì)胞與小鼠原代肝細(xì)胞的表達(dá)差異，小鼠原代肝細(xì)胞具有較豐富的CYP450酶，可直接應(yīng)用于藥物代謝和毒性評價研究[25]，而HepG2細(xì)胞CYP450蛋白表達(dá)水平較小鼠原代肝細(xì)胞低，影響其進(jìn)一步應(yīng)用于藥物代謝和毒性評價[26]，建議建立相應(yīng)CYP450酶穩(wěn)定表達(dá)HepG2細(xì)胞系后再應(yīng)用于此研究。