CYP3A4和CYP1A2及CYP2E1快速免疫印跡檢測(cè)方法的建立*

何俊奇， 楊暢， 陸定艷， 李靖， 劉歡， 王永林， 劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)，又稱(chēng)混合功能氧化酶(mixed function oxidase)和單加氧酶(monooxygenase)，是人體的主要藥物代謝酶之一，參與了超過(guò)90%的藥物代謝過(guò)程，主要存在于肝組織中[1-3]。CYP450包括多種酶，如CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C11、CYP2D6及CYP2C19等，其中CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1作為最為重要的幾種藥物代謝酶，對(duì)其蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)更是在藥物代謝研究中作為非常常見(jiàn)的檢測(cè)步驟[4-6]。免疫印跡法(Western blot)作為蛋白檢測(cè)中的定性與半定量方法，在蛋白表達(dá)的檢測(cè)過(guò)程中最為常見(jiàn)[7]，其原理就是將總蛋白按照分子量的大小進(jìn)行凝膠電泳分離，然后將目的蛋白轉(zhuǎn)移到比如聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)或者碳酸纖維素膜(notrocelluose filter membrane，NC)上，然后用特異性的抗原與其結(jié)合，從而對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)研究[8-10]。CYP450的Western blot檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要12 h以上[11-12]。因此本文對(duì)Western blot實(shí)驗(yàn)中最耗時(shí)的“封閉和抗體孵育”步驟加以?xún)?yōu)化，以期提高檢測(cè)效率。此外，CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1大多在肝臟高表達(dá)，如富含于肝臟勻漿、S9及肝微粒體，也是代謝實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的檢測(cè)樣品。HepG2細(xì)胞是目前常用的藥物吸收、分布、代謝、排泄(absorption，distribution，metabolism and excretion of drugs，ADME)模型細(xì)胞，監(jiān)測(cè)細(xì)胞中CYP450的表達(dá)水平，可推測(cè)其在體內(nèi)的代謝機(jī)理[13-16]。美國(guó)Millipore公司的SNAP i.d.2.0 Western blot快速孵育儀是一種利用真空抽壓的方式加速蛋白抗原抗體結(jié)合的儀器，能夠有效縮短抗體的孵育時(shí)間[17]。因此，本文選擇了HepG2細(xì)胞總蛋白、大鼠肝臟勻漿、S9及肝微粒體等代表性樣品，選用Western blot快速孵育儀來(lái)建立CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1快速免疫印跡檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 6只SPF級(jí)健康Sprague-Dawley雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司。人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophresis，SDS-PAGE)制備試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、牛血清白蛋白、吐溫-20、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶)，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(美國(guó)Thermo)，SDS-PAGE免染膠制備試劑盒(美國(guó)Bio-rad)，兔抗CYP3A4抗體、兔抗CYP2E1抗體、鼠抗CYP1A2抗體、辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體及山羊抗小鼠(英國(guó)Abcam)，預(yù)染蛋白marker(上海優(yōu)寧維)，放射免疫沉淀試驗(yàn)(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、超敏化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(上海碧云天)。

1.1.3主要儀器 SNAP i.d. 2.0 Western blot快速孵育儀(美國(guó)Millipore)，Trans-Blot Turbo蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀、Mini-PROTEAN Tetra C型垂直電泳槽及PowerPac Basic型電泳儀(美國(guó)Bio-rad)，fresco 17冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo)，Syngene G:BOX凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene)。

1.2 方法

1.2.1HepG2細(xì)胞樣品總蛋白的制備 人肝癌細(xì)胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取細(xì)胞匯合度約90%的HepG2細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，加4 ℃預(yù)冷的PBS磷酸鹽緩沖液3 mL洗滌細(xì)胞，棄洗液，重復(fù)洗滌2次。置于冰上加裂解液800 μL裂解，裂解完畢后將細(xì)胞液移入1.5 mL離心管中，渦混30 s，置于冰上反應(yīng)5～10 min，12 000 r/min離心10 min(離心機(jī)提前預(yù)冷至4 ℃)，取上清液根據(jù)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后-20 ℃冷藏備用。

1.2.2大鼠肝組織勻漿蛋白、S9及微粒體的制備 大鼠喂養(yǎng)7 d脫頸處死，取肝臟浸泡于0.25 mol/L蔗糖溶液，洗去多余的血后于離心管中剪碎，加蔗糖溶液500 μL勻漿，再加蔗糖溶液補(bǔ)齊至4 mL，混勻后得大鼠肝組織勻漿蛋白樣品；取制備好的大鼠肝組織勻漿蛋白，9 000 r/min離心15 min(離心機(jī)提前預(yù)冷至4 ℃)，取上清液19 000 r/min離心20 min，取上清即得大鼠肝S9樣品；取制備好的的大鼠肝組織勻漿蛋白，于9 000 r/min離心15 min(離心機(jī)提前預(yù)冷至4 ℃)，取上清液16 000 r/min離心30 min，重復(fù)操作1次，上清液按1 mL加88 mmol/L CaCl20.1 mL 混合置于冰上靜止5 min(靜置振搖1次/min)，16 000 r/min離心60 min，棄上清液，0.1 mol/L pH 7.4的Tris溶液洗滌沉淀，加Tris緩沖液5 mL重新混懸，即得大鼠肝微粒體。所有樣品-20 ℃冷藏備用。

1.2.3蛋白濃度測(cè)定 分別取待測(cè)蛋白樣品10 μL，標(biāo)準(zhǔn)品0 、2 、4 、6 、8 、12 、16 及20 μL加到96孔板中，PBS稀釋液補(bǔ)至20 μL，各檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔；各孔加 BCA工作液200 μL，37 ℃靜置反應(yīng)30 min；酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)在562 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和使用的樣品體積計(jì)算樣品的蛋白濃度。

1.2.4Western blot檢測(cè) (1)以CYP3A4為對(duì)象，優(yōu)化搖床封閉孵育條件，制備10%的SDS-PAGE常規(guī)凝膠和免染膠。取30 μg蛋白樣品與預(yù)染Marker上樣，80 V恒壓20 min，電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳70 min；電泳結(jié)束后，由下往上按照濾紙、PVDF膜、膠及濾紙的順利搭建轉(zhuǎn)膜“三明治”，并置于快速轉(zhuǎn)膜儀中轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉孵育及分組見(jiàn)表1。(2)優(yōu)化CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1的Western blot快速孵育儀封閉孵育條件：制備10%的SDS-PAGE常規(guī)凝膠，同前述進(jìn)行電泳分離，快速轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜30 min，封閉孵育及分組見(jiàn)表2?？贵w孵育完畢后，在PVDF膜上加 ECL發(fā)光混合液1 mL，室溫反應(yīng)1 min后放入凝膠成像儀器成像。

表1 搖床封閉孵育CYP3A4檢測(cè)條件Tab.1 CYP3A4 detection conditions of shaking incubation

表2 Western blot快速孵育儀孵育CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1檢測(cè)條件Tab.2 CYP3A4, CYP1A2 and CYP2E1detection conditions of Western blot rapid incubator

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CYP3A4搖床封閉孵育檢測(cè)條件優(yōu)化

Western blot結(jié)果顯示，與A、B、D、E、F組相比，C組的檢測(cè)結(jié)果背景干凈且條帶表達(dá)均一；HepG2樣品檢測(cè)中，C組檢測(cè)靈敏度高于A、B、D、E及F組(P>0.05)；組織勻漿樣品檢測(cè)中，C組檢測(cè)靈敏度高于A、B、E及F組(P<0.05或P<0.01)，條帶均一性高于A、B組；S9樣品檢測(cè)中，C組檢測(cè)靈敏度高于A、B、D及E組(P<0.05或P<0.01)，條帶均一性高于A、B組；肝微粒體樣品的檢測(cè)中，C組檢測(cè)靈敏度高于A、B、D、E及F組(P<0.05或P<0.01)，條帶均一性高于A、B組。見(jiàn)圖1。

注：與B組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.001。圖1 不同條件下CYP3A4蛋白的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 CYP3A4 detection results under different conditions

2.2 CYP3A4、1A2及2E1 Western blot快速孵育儀孵育檢測(cè)條件的優(yōu)化

選擇2.1中優(yōu)化的電泳條件對(duì)樣品蛋白進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜后，用Western blot快速孵育儀進(jìn)行封閉和抗體孵育條件的篩選。CYP3A4結(jié)果顯示，HepG2、組織勻漿及S9樣品檢測(cè)中C組檢測(cè)靈敏度均高于A、B組(P<0.05或P<0.01)，肝微粒體樣品檢測(cè)中C組檢測(cè)靈敏度高于B組(P<0.001)，且上述4種樣品中C組背景均較A、B組干凈；CYP1A2結(jié)果顯示，HepG2、組織勻漿和S9樣品中，F(xiàn)組檢測(cè)靈敏度與D、E組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，肝微粒體中F組檢測(cè)靈敏度低于D組(P<0.05)，但F組條帶均一性均高于D、E組、且背景也較D、E組干凈；CYP2E1結(jié)果顯示，HepG2樣品檢測(cè)中I組檢測(cè)靈敏度高于與G、H組、但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組織勻漿樣品檢測(cè)中I組檢測(cè)靈敏度高于G組(P<0.01)，S9樣品檢測(cè)中I組檢測(cè)靈敏度高于G、H組(P<0.01)，肝微粒體樣品的檢測(cè)中I組檢測(cè)靈敏度高于G組(P<0.05)，且上述4種樣品中I組條帶均一性及背景均較G、H組干凈。見(jiàn)圖2。

注：與C組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001;與F組比較，(4)P<0.05;與I組比較，(5)P<0.05,(6)P<0.01。圖2 不同快速孵育條件下CYP3A4、CYP2E1和CYP1A2蛋白檢測(cè)結(jié)果Fig.2 CYP3A4, CYP2E1 and CYP1A2 detection results under different rapid incubation conditions

3 討論

Western blot檢測(cè)作為一種常用的蛋白檢測(cè)技術(shù)，在CYP450蛋白檢測(cè)中運(yùn)用非常廣泛，但是目前對(duì)于該方法的優(yōu)化中大多是對(duì)洗脫時(shí)間及曝光時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，或者通過(guò)改變轉(zhuǎn)膜的時(shí)間與膜的孔徑來(lái)提高檢測(cè)效率，并沒(méi)有對(duì)于孵育方式及時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化的先例[18]。CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1作為CYP蛋白家族中的重要成員，也是實(shí)驗(yàn)中對(duì)于藥物代謝較為常見(jiàn)的CYP450酶[19]，因此本文選擇其作為檢測(cè)的對(duì)象[20-22]，建立CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1快速Western blot檢測(cè)方法。

本研究以CYP3A4為檢測(cè)對(duì)象，使用HepG2細(xì)胞總蛋白，大鼠肝組織的勻漿、S9及肝微粒體等樣品，對(duì)Western blot中分離膠類(lèi)型、轉(zhuǎn)膜電壓與時(shí)間、封閉時(shí)間及抗體孵育時(shí)間等常規(guī)條件進(jìn)行對(duì)比，篩選出了較為優(yōu)化的檢測(cè)條件。結(jié)果表明使用常規(guī)的SDS-PAGE凝膠和快速轉(zhuǎn)膜30 min便可達(dá)到較好的分離和轉(zhuǎn)膜效果。因此，在以Western blot快速孵育儀進(jìn)行快速檢測(cè)條件優(yōu)化時(shí)，選用了較為經(jīng)濟(jì)的常規(guī)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，并采用了30 min快速轉(zhuǎn)膜條件。對(duì)快速封閉孵育條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，CYP3A4最佳快速檢測(cè)條件是一抗(3 ∶2 500)快速孵育儀孵育30 min，二抗孵育20 min；CYP2E1最佳快速檢測(cè)條件是快速孵育儀封閉30 min、一抗(3 ∶2 500)孵育20 min、二抗孵育10 min；CYP1A2蛋白快速檢測(cè)條件是以快速孵育儀封閉30 min、一抗(3 ∶2 500)孵育20 min、二抗孵育20 min。

在Western blot條帶圖中，可以明顯看到CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1在微粒體中的豐度高于S9和勻漿中的量，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)CYP酶存在于微粒體膜上[23-25]；而在HepG2組中，CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1蛋白條帶的信號(hào)較弱，這與HepG2細(xì)胞中這3種CYP酶表達(dá)量極低相關(guān)[26]。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合理論預(yù)期，也從側(cè)面證明了本文開(kāi)發(fā)的方法的可靠性。

綜上所述，本文首先以CYP3A4為例，優(yōu)化其常規(guī)Western blot檢測(cè)的孵育方式，然后再利用Western blot快速孵育儀對(duì)CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1的孵育方式進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)比搖床孵育結(jié)果可以看出，優(yōu)化的Western blot快速孵育條件在條帶一致性和背景等檢測(cè)效果上與常規(guī)搖床孵育的方式差異不大，但是極大縮短了檢測(cè)時(shí)間(12 h縮短至1 h)，提升了實(shí)驗(yàn)效率。