史麗 馬靜 趙喜娃 關(guān)英霞 孫亞平 趙連梅 單保恩
子宮內(nèi)膜癌在女性生殖道惡性腫瘤中所占比例高達(dá)20%~30%,通常早期子宮內(nèi)膜癌臨床預(yù)后較好,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),無論何種病理類型及分期均會(huì)導(dǎo)致較差的預(yù)后[1]。近年來,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[2],因此,探索有效的腫瘤標(biāo)志物對子宮內(nèi)膜癌早期診斷及制定治療方案有重要的意義。B細(xì)胞異位基因2(B-cell translocation gene 2,BTG2)是 BTG/TOB 蛋白家族中的六位成員之一[3],該家族成員能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[3,4]。一項(xiàng)研究結(jié)果顯示,在惡性腫瘤中BTG2存在表達(dá)失調(diào),在一系列惡性腫瘤中具有抑癌作用,BTG2 是一個(gè)瞬時(shí)早期反應(yīng)基因,有參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡以及綜合性應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)行為,可以用作各種癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物[5]。但是,BTG2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、作用的關(guān)系以及能否作為預(yù)后指標(biāo)還不清楚。因此,本研究采用qRT-PCR、Western-blot以及免疫組化方法檢測BTG2在子宮內(nèi)膜癌組織中的基因及蛋白水平表達(dá)情況,并分析其表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。
1.1 一般資料 選取2018年1~12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者40例,年齡(55±8)歲,選取癌組織和癌旁組織分為癌組和癌旁組。癌旁取材標(biāo)準(zhǔn)為距離腫瘤邊緣3 cm,并經(jīng)病理證實(shí)為非癌組織,將所取新鮮組織立即在液氮中冷凍,并儲(chǔ)存在-80℃。另選取2016年1月至2017年12月子宮內(nèi)膜癌患者(試驗(yàn)組)內(nèi)膜癌組織標(biāo)本98例,年齡(54±9)歲,根據(jù) 2009 年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期(FIGO2009),Ⅰ、Ⅱ期 58例,Ⅲ、Ⅳ期 40例;組織病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌 76 例,非子宮內(nèi)膜樣腺癌22例(漿液性腺癌16例、透明細(xì)胞癌4例、未分化癌2例)。 選擇同期因良性病變行子宮切除或內(nèi)膜切除且病理檢查證實(shí)子宮內(nèi)膜良性病變的組織標(biāo)本 80例(對照組),年齡(52±10)歲,2組患者一般資料有可比性(P>0.05)。所有子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前未接受放療、化療和激素治療,患者及其家屬均簽署了知情同意書,該研究獲得了河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院的倫理學(xué)批準(zhǔn)。
1.2 材料與試劑 Trizol試劑和PCR引物購自美國Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自美國 Thermo公司,GAPDH 抗體購自美國 Proteintech公司。
1.3 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR(Real-Time Quantitative PCR,RT-PCR)檢測組織中mBTG2的相對表達(dá)水平。 用 TRIzol 試劑提取組織中總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),在20 μl體系中加 3 μg總RNA 進(jìn)行 cDNA 合成。 根據(jù)RT-PCR 試劑盒說明書,以合成的 cDNA 為模版,加入反應(yīng)試劑,進(jìn)行 PCR 反應(yīng),以GAPDH基因作為內(nèi)參照。Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)BTG2引物,BTG2上游為 5’-CATCATCAGCAGGGTGGC-3’,下游為 5’-CCCAATGCGGTAGGACAC-3’,擴(kuò)增片段大小為122 bp;GAPDH內(nèi)參的上游引物為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’,下游引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’,擴(kuò)增片段大小為119 bp。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所獲Ct值對BTG2進(jìn)行相對定量,用比較Ct值法(2-ΔCt)進(jìn)行分析(ΔCt=CT BTG2-CT GAPDH)。
1.4 Western-blot方法檢測組織中BTG2的蛋白表達(dá)水平 將癌組組和癌旁組各組織應(yīng)用RIPA 裂解液提取各組組織中的總蛋白質(zhì)。BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。具體步驟為:配制SDS-PAGE的凝膠,將蛋白變性后的上清,分別加入濃縮膠的上樣孔中;取4 μl蛋白marker加于上樣孔。4℃條件下,恒壓90 V,電泳緩沖液中泳動(dòng)3 h,根據(jù)蛋白分子量不同進(jìn)行分離。根據(jù)目的蛋白大小將分離的蛋白區(qū)帶凝膠切下,置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡,PVDF膜先在甲醇中浸泡3 min,再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5 min。將PVDF膜平鋪在凝膠上,PVDF膜和凝膠兩側(cè)各放三層濾紙,凝膠在負(fù)極,PVDF膜在正極,放入電轉(zhuǎn)儀中,4℃條件下進(jìn)行印記電泳(300 mA,1.5 h)。 取出PVDF膜,用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h。TBST洗膜10 min×3次,加入TBST稀釋的相應(yīng)的一抗,4℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次,加入TBST稀釋的紅外熒光標(biāo)記的二抗,37℃反應(yīng)1 h,注意避光。 TBST洗膜10 min×3次(避光),用Odyssey雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)進(jìn)行成像并分析。
1.5 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法 脫蠟:石蠟切片標(biāo)記后,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,蒸餾水震蕩沖洗。封酶并抗原修復(fù),稀釋BTG2抗體:用PBS將一抗稀釋至所需的濃度(1∶50);血清封閉并滴加一抗過夜,次日取出放入37℃恒溫箱中孵育50 min,取出組織切片用PBS清洗3次(震蕩),每次5 min;滴加二抗(pv6001):在每個(gè)組織塊上加入50 μl左右的二抗并DAB顯色并蘇木素復(fù)染,脫水封片并顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為低表達(dá)組:弱表達(dá)(+)和中表達(dá)(++);高表達(dá)組,強(qiáng)表達(dá)(+++)。
2.1 癌組及癌旁組BTG2的mRNA的相對表達(dá)水平 應(yīng)用RT-PCR方法檢測2組BTG2的mRNA的相對表達(dá)水平,癌組及癌旁組分別為(0.24±0.13)、(0.51±0.22),子宮內(nèi)膜癌組BTG2的相對表達(dá)量明顯低于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
2.2 癌組及癌旁組BTG2蛋白的相對表達(dá)水平 應(yīng)用Western-blot方法檢測2組BTG2蛋白表達(dá)水平,癌組和癌旁組的相對表達(dá)水平分別為(0.99±0.08)、(2.16±0.12),癌組BTG2 蛋白相對表達(dá)量明顯低于癌旁組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。
圖1 癌組及癌旁組BTG2蛋白的相對表達(dá)水平
2.3 子宮內(nèi)膜癌和內(nèi)膜良性病變組織中 BTG2的蛋白表達(dá)水平 應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測BTG2在子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)情況顯示BTG2在子宮內(nèi)膜細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。試驗(yàn)組:低表達(dá)78例(79.6%),高表達(dá)20例(20.4%);對照組:低表達(dá)24例(30.0%),高表達(dá)56例(70.0%),2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜癌組織中BTG2的蛋白表達(dá)水平明顯低于子宮內(nèi)膜良性病變組織。見圖2,表1。
子宮內(nèi)膜良性病變組織子宮內(nèi)膜癌組織
表1 不同子宮內(nèi)膜病變組織中BTG2蛋白表達(dá) 例(%)
2.4 子宮內(nèi)膜癌組織中 BTG2 的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 BTG2 表達(dá)水平與臨床分期、組織分級(jí)、淋巴血管浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān):臨床期別越高,BTG2的表達(dá)水平越低;病理分級(jí)越高BTG2的表達(dá)水平越低;存在血管、淋巴管浸潤的BTG2的表達(dá)水平降低;存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BTG2的表達(dá)水平降低;BTG2 表達(dá)水平與年齡、肌層浸潤深度、組織類型無關(guān)。見表2。
表2 子宮內(nèi)膜癌組織中BTG2蛋白表達(dá)與不同臨床病理特征的關(guān)系 例(%)
子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。近年來對于子宮內(nèi)膜癌的病因?qū)W研究屢見報(bào)道,如PTEN基因突變和丟失、DNA錯(cuò)配導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定等[6,7];除了針對基因的研究,調(diào)節(jié)基因的變化和多位點(diǎn)調(diào)節(jié)也是目前研究的熱點(diǎn),如長鏈非編碼基因、microRNA等[8]。BTG2 是于 1996 年 被 Rouault 等[9]發(fā)現(xiàn),其基因位于1q32,僅由兩個(gè)外顯子組成。BTG2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),可以在人體腎臟,肺,前列腺,胰腺,胸腺等器官中檢測到BTG2[10]。有研究表明,BTG2 是一個(gè)瞬時(shí)早期反應(yīng)基因,有參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡以及綜合性應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)行為[11,12]。有研究顯示,BTG2是腫瘤抑制基因,BTG2的mRNA表達(dá)受microRNAs.調(diào)控,比如在BTG2的mRNA的3’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)多達(dá)17個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)參與BTG2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[13]。BTG2在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌[14-17]等多個(gè)器官的實(shí)體瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá)。本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)BTG2在子宮內(nèi)膜組織中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),癌組織中表達(dá)水平較子宮內(nèi)膜良性病變組織明顯減少,應(yīng)用RT-PCR、Western-blot相對定量檢測同樣發(fā)現(xiàn)了BTG2在子宮內(nèi)膜癌組織中的基因以及蛋白表達(dá)水平均低于癌旁或子宮內(nèi)膜良性病變組織,BTG2在內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá),提示了BTG2可能參與了抑制子宮內(nèi)膜癌疾病進(jìn)展的過程。
多項(xiàng)既往研究結(jié)果顯示,BTG2通過相應(yīng)的分子機(jī)制在實(shí)體腫瘤組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)水平,并且BTG2低表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)[18]。如在前列腺癌中,BTG2是miR-32,miR-21的靶標(biāo),通過后者的抑制作用導(dǎo)致BTG2低表達(dá),低水平BTG2會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療耐藥性和轉(zhuǎn)移等[15];在乳腺癌中,通過細(xì)胞周期蛋白D1高表達(dá)/AKT磷酸化升高從而下調(diào)BTG2,并且低水平的BTG2與腫瘤等級(jí)、疾病進(jìn)展和低總生存率相關(guān)[16];肝癌中,通過細(xì)胞周期蛋白D1 /細(xì)胞周期蛋白E的升高下調(diào)BTG2水平,并且低表達(dá)的BTG2水平導(dǎo)致腫瘤等級(jí)增加并與臨床病理的分化程度、是否肝硬化、癌栓、轉(zhuǎn)移情況及總生存期具有明顯相關(guān)性[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)microRNA參與調(diào)控了子宮內(nèi)膜癌中癌基因或抑癌基因的表達(dá)并在疾病發(fā)展及治療中發(fā)揮一定的作用[19-21],本課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)miR-25-3p有可能參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌組織中BTG2的表達(dá)[22]。本研究結(jié)果表明BTG2呈現(xiàn)低表達(dá)并與子宮內(nèi)膜癌臨床病理之間的存在一定的相關(guān)性,其中病例組中FIGOⅠ、Ⅱ期 和Ⅲ、Ⅳ期 相比BTG2表達(dá)具有差異性,臨床期別越高BTG2的表達(dá)水平越低;病理分級(jí)越高BTG2的表達(dá)水平越低;存在血管、淋巴管浸潤的BTG2的表達(dá)水平降低;存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的BTG2的表達(dá)水平降低,上述結(jié)果均表明BTG2的低表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),有可能成為內(nèi)膜癌疾病基因靶向治療的節(jié)點(diǎn)。
綜上所述,BTG2在子宮內(nèi)膜癌組織異常低表達(dá)并臨床病理分期、分級(jí)、淋巴管血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們推測BTG2可能抑制了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展,有望成為子宮內(nèi)膜癌的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)及病情監(jiān)測指標(biāo),這與其它相關(guān)研究結(jié)果一致。但是,BTG2在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病中的具體作用機(jī)制尚未明確,這點(diǎn)將是我們課題組下一步研究的重點(diǎn)。