華中部分地區(qū)發(fā)病豬群血清樣品PCV-2 病原學(xué)檢測(cè)

（長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科，是迄今為止脊椎動(dòng)物中最小的DNA 病毒之一[1]。PCV 有多個(gè)血清型，如PCV-1、PCV-2及PCV-3 等[2-4]。PCV-1 是豬腎細(xì)胞系的污染物，對(duì)豬無(wú)致病性，但能產(chǎn)生血清抗體。相比之下，PCV-2 具有致病性，以侵害動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)為主，是公認(rèn)的世界上危害最嚴(yán)重的豬病病原之一[4-6]，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和皮炎與腎病綜合征（PNDS）的主要病因。PCV-2 可感染各階段豬群：5～16 周齡階段，易導(dǎo)致PMWS；育肥后期（16～22 周齡），則更多表現(xiàn)呼吸疾病綜合征[7-9]。最近發(fā)現(xiàn)的PCV 3 與豬皮炎與腎病綜合征以及生殖衰竭、心臟和多系統(tǒng)炎癥有關(guān)，但其致病機(jī)制尚不清楚[10-11]。

為了解華中地區(qū)臨床發(fā)病豬群PCV-2 感染狀況及特點(diǎn)，2018—2019 年，從湖南省、湖北省部分地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)，采集1 550 份臨床發(fā)病豬樣本，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的巢式PCR 方法進(jìn)行PCV2 病原學(xué)檢測(cè)，并分析不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖階段、不同季節(jié)及與其他疾病混合感染情況，以期為今后PCV-2 凈化提供依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

2018 年3 月—2019 年2 月，從湖北省的武漢、隨州、咸寧、荊州，湖南省的常德、衡陽(yáng)、汨羅、株洲等8 個(gè)地市的40 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（存欄量＞500頭），采集出現(xiàn)PMWS、PDNS、繁殖障礙、傳染性先天性震顫（CT）、腹瀉等臨床癥狀的發(fā)病豬群，每月1 次采樣（前腔靜脈采血），共計(jì)采集1 550份血清樣品，-20 ℃保存待檢（表1）。被檢豬場(chǎng)均按各自制定的PCV-2 免疫程序進(jìn)行免疫。

表1 樣品采集信息統(tǒng)計(jì) 單位：份

1.2 主要試劑

Taq-DNA 聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖，為Spanish 公司產(chǎn)品；TS-GelRed 核酸凝膠染料、DL-2000 DNA Marke、瓊脂糖，購(gòu)于擎科生物科技有限公司；AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit試劑盒，購(gòu)至美國(guó)AXYGEN 公司。

1.3 樣品處理及病毒核酸提取

將采集的全血1 500 r/min 離心30 min，取上清；按照Axygen 體液提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)上清進(jìn)行病毒核酸提取；用Nanodrop 1 000 檢測(cè)所提取DNA 的濃度和純度，然后將DNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原學(xué)檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的巢式PCR 檢測(cè)方法[12-15]，對(duì)樣品進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。引物序列如表2 所示。

表2 擴(kuò)增糖蛋白基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)不同地區(qū)、不同養(yǎng)殖階段、不同季節(jié)及混合感染的檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS 24.0 卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，P＞0.05 為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)

不同地區(qū)檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示：湖南、湖北兩省8 個(gè)地市的PCV-2 檢出率在8.79%～49.01%之間波動(dòng)，平均檢出率為31.68%（491/1 550），其中常德市最高（49.01%），其次是武漢、咸寧、衡陽(yáng)、株洲、荊州、汨羅，隨州市最低（8.79%）。該結(jié)果表明，這2 個(gè)省區(qū)的規(guī)?；i場(chǎng)均存在不同程度的感染，且不同地市間PCV-2 檢出率差異顯著（P＜0.05）。

圖1 不同地區(qū)豬群PCV-2 檢出率分布

2.2 不同養(yǎng)殖階段

不同養(yǎng)殖階段檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示：各養(yǎng)殖階段豬群均有PCV-2 陽(yáng)性檢出，檢出率在12.17%～60.84%之間，其中育肥豬（60.84%）和保育豬（58.29%）檢出率較高，而哺乳仔豬（16.87%）、經(jīng)產(chǎn)母豬（14.04%）和后備豬（12.17%）偏低。不同養(yǎng)殖階段豬群的PCV2 檢出率差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同季節(jié)

不同季節(jié)檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示：PCV-2 一年四季均有流行，但具有一定的季節(jié)性，其中夏季（6—8 月）檢出率最高（49.81%），而春季（3—5 月）最低（5.98%）。不同季節(jié)PCV-2 檢出率差異顯著（P＜0.05）。

圖2 不同養(yǎng)殖階段豬群PCV-2 檢出率分布

圖3 不同季節(jié)豬群PCV-2 檢出率分布

2.4 混合感染

將送檢的1 550 份臨床樣品同時(shí)進(jìn)行PCV-2、PCV-3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）病原學(xué)檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示：除PCV-3 未檢出外，其他4 種病原均存在不同程度的單一感染，其中PRRSV 單一感染率（32.39%）最高，其次是PRV（19.81%），PPV 較 低（13.55%），而PCV-2單一感染最低（2.45%）；雙重感染（49.74%，771/1550）最為常見(jiàn)，以PCV-2+PRRSV 為主，其次是PCV-2+PRV，PCV-2+PPV 最低；三重感染率（16.58%）較低，以PCV-2+PRRSV+PRV 為主，其次是PCV-2+PRRSV+PPV，PCV-2+PRV+PPV最低。四重感染（0.06%，1/1550）極少。單一感染、雙重感染、三重感染的檢出率差異顯著（P＜0.05）。

表3 PCV-2 混合感染情況

3 討論

隨著規(guī)模豬場(chǎng)數(shù)量的逐漸增多，生豬交易愈加頻繁，PCV-2 感染率也逐年提高，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害。本研究對(duì)2018—2019 年華中地區(qū)湖南、湖北兩省8 個(gè)地市規(guī)模場(chǎng)送檢的發(fā)病豬血清樣品進(jìn)行PCV-2 病原學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCV-2 檢出率在8.79%～49.01%之間，表明PCV-2 在兩省規(guī)?；i場(chǎng)普遍流行，平均檢出率為31.68%，表明流行較為嚴(yán)重。韋顯凱等[16]2016 年對(duì)廣西部分地區(qū)豬群5 種疫病流行情況監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCV-2 檢出率為39.12%；蔣新華等[17]對(duì)2013—2017 年采集自江西省10 個(gè)地區(qū)的1 082 份疑似PCV-2 感染豬病料組織進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，610 份為PCV-2 陽(yáng)性，總檢出率為56.4%。上述結(jié)果均表明，PCV-2 在我國(guó)流行廣泛且較為嚴(yán)重，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)形成較大危害。不同地區(qū)間的差異，通常與豬場(chǎng)的飼養(yǎng)密度、環(huán)境控制及管理水平有關(guān)，也可能受地理環(huán)境及自然氣候等因素影響。湖南省養(yǎng)豬業(yè)較密集，豬只調(diào)運(yùn)較頻繁，PCV-2 通過(guò)拉豬車、污染的工具、糞便等傳播的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，實(shí)行封閉性管理，發(fā)現(xiàn)可疑病豬應(yīng)及時(shí)隔離，并加強(qiáng)外進(jìn)貨物、車輛、返廠人員的消毒，防止病原傳入。感染率低的地區(qū)應(yīng)對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行有效隔離，斷絕與其他健康豬只的接觸，盡可能控制PCV-2 的橫向傳播，同時(shí)嚴(yán)格把控引種豬只來(lái)源，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)。

不同養(yǎng)殖階段豬群檢測(cè)結(jié)果顯示，PCV-2 可感染各養(yǎng)殖階段豬群。育肥豬（60.84%）和保育豬（58.29%）感染較為嚴(yán)重，而哺乳仔豬（16.87%）、經(jīng)產(chǎn)母豬（14.04%）、后備豬（12.17%）較輕，這與劉冰許等[18]對(duì)2015 年新鄉(xiāng)市PCV-2 病原學(xué)檢測(cè)的結(jié)果相近。哺乳仔豬通過(guò)攝取初乳獲得母源抗體保護(hù)，從而免受PCV-2 侵害[19]。也有研究[4]表明，仔豬在母源抗體降至臨界值時(shí)，如果疫苗免疫不及時(shí)，往往在仔豬斷奶后轉(zhuǎn)至保育時(shí)出現(xiàn)PMWS 癥狀，這也解釋了保育豬群感染的主要原因。而育肥豬的飼養(yǎng)密度較大，豬舍環(huán)境、管理水平都有所欠缺，豬群通過(guò)口-鼻-糞或者污染工具在豬群中水平傳播，因而感染概率較高。因此，仔豬應(yīng)在3～6周齡接種PCV-2 疫苗；育肥、保育豬養(yǎng)殖密度較大，可適當(dāng)增設(shè)通風(fēng)口、排氣扇，對(duì)轉(zhuǎn)棟、轉(zhuǎn)欄的豬舍（環(huán)境棉拭子）、豬只（鼻/肛拭子）的PCV-2 病原學(xué)抽樣檢測(cè)，做到環(huán)境、豬只雙陰性方可轉(zhuǎn)群；對(duì)母豬應(yīng)采取PCV-2 疫苗普免（3～4 次/年）。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)PCV-2感染具有一定季節(jié)性，其中夏季和冬季是感染高峰期，與段群棚等[20]調(diào)查的結(jié)果基本一致。分析原因，華中地區(qū)夏熱冬寒，濕度高，冷熱應(yīng)激可引起豬群不適，導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，而PCV-2 可侵害豬免疫系統(tǒng)，抑制體內(nèi)免疫應(yīng)答，影響PCV-2 疫苗的效力，從而導(dǎo)致感染率升高。因此，夏、冬季應(yīng)嚴(yán)格控制豬舍溫度，避免因冷熱應(yīng)激致使豬群的免疫力降低，且PCV-2免疫程序也需參考當(dāng)?shù)貧鉁刈兓M(jìn)行調(diào)整。同時(shí)，也需加強(qiáng)夏、冬季的綜合防疫工作。

本檢測(cè)結(jié)果顯示，PRRSV 單一感染率較高，與PCV-2 的雙重感染和三重感染較為多見(jiàn)，與段群鵬[21]的觀點(diǎn)一致。這是因?yàn)镻CV-2 主要侵害豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，從而引起多種病原協(xié)同感染。因此，規(guī)?；i場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)豬群的PCV-2 病原學(xué)監(jiān)測(cè)，完善生物安全體系，在做好PCV-2 流行控制的同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)其他疾病的防控和治理。

4 結(jié)論

綜上所述，湖南、湖北兩省PCV-2 分布較為廣泛，一年四季皆有流行，可感染所有養(yǎng)殖階段豬群，與其他病原的混合感染嚴(yán)重，但其流行有一定的地市、豬群和季節(jié)差異，其中保育豬群感染最嚴(yán)重，夏、冬季節(jié)高發(fā)。建議加強(qiáng)高流行地區(qū)、重點(diǎn)豬群、高發(fā)季節(jié)的免疫、檢測(cè)以及生物安全管理，逐步控制和凈化PCV-2。