火焰衛(wèi)矛微型快繁關鍵技術的建立

（北京林業(yè)大學 a.生物科學與技術學院；b.林木育種國家工程實驗室，北京 100083）

衛(wèi)矛Euonymus alatus，為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬落葉灌木，嫩枝綠色、無毛，老枝長有木栓質的翅，花淺紅色或淺黃色，葉片春季深綠色，秋季變?yōu)檠t色或火焰紅色[1]，是一種具有重要觀賞價值和經濟價值的園藝觀賞植物。在長期選育中，逐漸形成了多個栽培種，如‘KoshoMayune’、‘Timber Creek’、‘Compactus’、‘Odom’、‘Rudy Haag’和‘Pipzam’等。其中，火焰衛(wèi)矛Euonymus alatuscv.‘Compacta’因其樹枝密集，樹形豐滿而備受喜愛。僅在美國康涅狄格洲，火焰衛(wèi)矛的年銷售額便達到5×106美元[2]。研究火焰衛(wèi)矛微型快繁技術，不僅可以提高火焰衛(wèi)矛產量，還可以保持母株的優(yōu)良性狀。

植物離體快繁的理論基礎是植物細胞全能性。自1839年細胞學家Schwann 提出其假說以來，歷經120 a 持續(xù)探索深入，1958年Steward 等通過胡蘿卜體細胞誘導再生完整植株[3]獲得證明。隨著植物組織培養(yǎng)技術日趨成熟，被用于單倍體育種、多倍體育種等細胞工程育種育苗科學技術研究[4,5]，亦用于產業(yè)化微型快速繁殖。楊超臣等利用香椿種子萌發(fā)的幼苗莖段為材料，構建了香椿無性組培快繁技術[6]；孫紅英等以日本紅楓‘青龍’的半木質化莖段為材料，構建了‘青龍’組培快繁體系[7]。觀賞園藝植物火焰衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)亦得到關注。Chen 與祖慶學等先后以火焰衛(wèi)矛子葉為材料，經遺傳轉化后，再生形成了新的植株[8,9]；Thammina 等通過火焰衛(wèi)矛胚乳組織的離體培養(yǎng)，再生新的植株，培育出三倍體植株[2]。趙麗蒙以衛(wèi)矛莖段為材料，經表層消毒后，誘導愈傷組織再生不定芽[10]。這些研究為火焰衛(wèi)矛基因工程育種及倍性育種基礎，也為推廣火焰衛(wèi)矛新品種并保持其優(yōu)良形狀、建立火焰衛(wèi)矛微型快繁技術進行了探索。

植物細胞生長分化受生長調節(jié)劑、培養(yǎng)基類型及糖類影響[11]。不定芽與不定根的誘導受到生長素和細胞分裂素的相對濃度調節(jié)，當生長素濃度較高時有利于不定根形成，當細胞分裂素濃度較高時有利于不定芽分化[12]，且在不同物種的組織培養(yǎng)中，激素配比各不相同。植物微型快繁亦受到培養(yǎng)基類型的影響，不同培養(yǎng)基類型對植物組織培養(yǎng)具有不同效果，如相較于MS、WPM、NN 及DKW 培養(yǎng)基，平歐雜交榛外植體在NRM培養(yǎng)基上增殖分化效果更好[13]；而杜仲在MS 培養(yǎng)基的增殖效果明顯優(yōu)于在B5、White 等培養(yǎng)基上的增殖效果[14]。糖類在植物組織培養(yǎng)中亦發(fā)揮至關重要的作用，不僅參與能量供給，而且可以調節(jié)環(huán)境滲透壓[15]。最新研究表明，糖類濃度還可通過調控BRI1 和BAK1 基因，進而參與G 蛋白信號傳導，調控植物生長發(fā)育[16]。

本研究基于植物微型快繁進程的5 個階段，母株的選擇和養(yǎng)護，無菌體系的建立，不定芽擴增，不定根誘導及移栽馴化，分析火焰衛(wèi)矛不定芽增殖和不定根誘導的影響因素，專門研究火焰衛(wèi)矛快繁各培養(yǎng)階段的最佳條件，建立火焰衛(wèi)矛微型快繁技術。實驗以火焰衛(wèi)矛組培苗為材料，以影響植物離體培養(yǎng)的因素（培養(yǎng)基類型, 植物生長調節(jié)劑及蔗糖濃度）為研究對象，利用正交實驗設計、方差數據分析等方法，探究這些因素對火焰衛(wèi)矛不定芽增殖及不定根誘導的影響，優(yōu)化火焰衛(wèi)矛不定芽增殖和不定根誘導條件，為火焰衛(wèi)矛微型繁殖生產提供理論基礎和技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紅葉衛(wèi)矛Euonymus alatuscv.‘Compacta’組培苗由美國康涅狄格大學李義教授饋贈，取材于美國康涅狄格洲黎巴嫩鎮(zhèn)PridesCorner 農場。取繼代增殖培養(yǎng)1 a 后的健壯組培苗，用于以下各項實驗。

1.2 培養(yǎng)條件對不定芽增殖的影響

對影響紅葉衛(wèi)矛不定芽增殖的因素（培養(yǎng)基類型、6-BA 濃度、IBA 濃度及蔗糖濃度），進行4 因素4 水平正交實驗設計，共16 個處理（表1），并據此配制增殖培養(yǎng)基。所有增殖培養(yǎng)基的pH 值為5.8，瓊脂濃度為6 g·L-1。選取生長健壯的紅葉衛(wèi)矛組培苗，分別接種于16 種增殖培養(yǎng)基上，并置于組織培養(yǎng)間內培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度（24±1）℃，光照強度3 000 lx，光周期16 h/8 h（光/暗）。5 周后，統(tǒng)計測量腋芽萌發(fā)數、腋芽生長量、頂芽生長量，計算增殖系數=腋芽萌發(fā)數/接種外植體數，平均生長量=（腋芽生長量+頂芽生長量）/接種外植體數。正交實驗設計共16個處理，每個處理設3 個重復，每個重復接種30 株，共計1 440 株。

1.3 培養(yǎng)條件對生根的影響

1.3.1 生根階段Ⅰ的激素配比、蔗糖濃度及處理時間對不定根誘導的影響

本研究以二步法誘導組培苗生根。在生根階段Ⅰ中，對影響不定根誘導的培養(yǎng)條件（IBA 濃度、NAA 濃度、蔗糖濃度、處理時間）進行了四因素四水平正交試驗設計（表2）。以1/2 WPM為基本培養(yǎng)基，根據表2配制生根培養(yǎng)基Ⅰ。選取生長健壯的火焰衛(wèi)矛組培苗，分別接種于16 種生根培養(yǎng)基Ⅰ上，并置于組織培養(yǎng)間內培養(yǎng)。正交實驗設計共16 個處理，每個處理設3 個重復，每個重復接種30 株，共計1 440 株。經生根培養(yǎng)基Ⅰ誘導后，將組培苗轉移到生根培養(yǎng)基Ⅱ（1/2 WPM+蔗糖20 g·L-1+活性炭2.0 g·L-1）上培養(yǎng)4周，統(tǒng)計生根率=生根外植體數/接種外植體數*100%；平均生根數=不定根總數/接種外植體數；平均根長=不定根總長度/不定根總數。

1.3.2 生根階段Ⅰ的培養(yǎng)基類型與培養(yǎng)基強度對不定根誘導的影響

為進一步優(yōu)化生根培養(yǎng)基Ⅰ，在最佳激素配比及蔗糖濃度的基礎上，繼續(xù)探究了培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)基強度對生根情況的影響。將生長健壯的組培苗分別接種于DKW 培養(yǎng)基和WPM 培養(yǎng)基不同強度（1/2、1/3、1/4）的生根培養(yǎng)基Ⅰ上。每個處理設3 個重復，每個重復30 個樣品，共計540 株。在生根培養(yǎng)基Ⅱ（1/2 WPM+蔗糖20 g·L-1+活性炭2.0 g·L-1）上培養(yǎng)4 周后，統(tǒng)計生根情況。

1.3.3 生根階段Ⅱ的蔗糖濃度對生根的影響

在最佳生根培養(yǎng)基Ⅰ的基礎上，研究了生根階段Ⅱ的蔗糖濃度對生根的影響。將在生根培養(yǎng)基Ⅰ培養(yǎng)后的火焰衛(wèi)矛組培苗轉接至含不同濃度蔗糖和活性炭2.0 g·L-1的1/4 WPM 培養(yǎng)基上，組培間內培養(yǎng)4 周后，統(tǒng)計生根情況。

1.4 生根組培苗的芽休眠解除與移栽、煉苗

生根后的火焰衛(wèi)矛組培苗普遍存在芽休眠現象。為解除生根組培苗芽休眠，提高組培苗移栽成活率，將生根后的組培苗轉移至冰箱中，4 ℃黑暗處理3 個月[2]，而后轉移至組培間內培養(yǎng)兩周。將生根組培苗置于散射光的煉苗間（25±1℃），并于一周內逐漸打開培養(yǎng)瓶蓋，使組培苗逐漸適應空氣濕度變化。分別取30 株健壯組培苗移栽至珍珠巖∶草炭土=1∶1 和僅含珍珠巖的花盆中，并設3 個重復，培養(yǎng)于溫室內。移栽第一周，在花盆上覆蓋塑料薄膜，每天澆水一次；第二周逐漸將塑料薄膜掀開，改為每兩天澆水一次。50 d 后，統(tǒng)計移栽苗成活率。待移栽苗長出新葉后，將植株栽種于田間。

1.5 數據分析

采用SPSS 的ANOVA 法，以培養(yǎng)基類型、6-BA濃度、IBA 濃度及蔗糖濃度為固定因子，以不定芽增殖或不定根誘導的相關統(tǒng)計結果為因變量，進行單變量方差分析，確定各因素在不同階段是否具有顯著影響；并對具有顯著影響的培養(yǎng)條件進行均值比較，確定最佳的火焰衛(wèi)矛培養(yǎng)條件。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對不定芽增殖的影響

火焰衛(wèi)矛莖段接種于16 種增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 周后，觀察莖段生長情況。發(fā)現火焰衛(wèi)矛莖段在MS、WPM 及DKW 培養(yǎng)基均能大量誘導不定芽形成，其中在DKW 培養(yǎng)基上生長狀況最好，葉色嫩綠，莖段直立；但在B5 培養(yǎng)基上生長很差，接種的莖段生長緩慢，只有極少的莖段在五周后分化出不定芽，說明B5 培養(yǎng)基不適用于火焰衛(wèi)矛的莖段培養(yǎng)。接種在含不同蔗糖濃度培養(yǎng)基上，火焰衛(wèi)矛莖段生長長度隨蔗糖濃度增加而增長。但當蔗糖濃度超過30 g·L-1后，葉片出現變紅的現象，生長量降低。統(tǒng)計腋芽萌發(fā)數、腋芽生長量、頂芽生長量，計算增殖系數及平均生長量。不同處理下，增值系數最小值為1.14，最大值為3.73；平均生長量最小值為0.08 cm，最大值為2.03 cm（表1）。經SPSS 方差分析，培養(yǎng)基類型與6-BA 濃度對增殖系數影響極顯著（P＜0.01），而IBA 濃度與蔗糖濃度對其影響不顯著；培養(yǎng)基類型、6-BA 濃度與蔗糖濃度對平均生長量具有極顯著影響（P＜0.01），IBA 濃度影響不顯著。對顯著影響因素進行均值比較，發(fā)現6-BA 濃度為4.0 mg·L-1，培養(yǎng)基類型為WPM 或DKW 時，增殖系數最大；培養(yǎng)基類型為DKW、6-BA 濃度為0.5 mg·L-1、蔗糖濃度為30 g·L-1時，平均生長量最大。綜合考慮各因素對增殖系數和平均生長量的影響，確定火焰衛(wèi)矛莖段增殖的最佳條件為DKW+6-BA 4.0 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1+ 蔗糖30 g·L-1。本研究中與最佳條件相似的處理為處理13，繁殖系數為3.73，平均生長量為1.07 cm，且萌發(fā)的腋芽葉色嫩綠，生長旺盛（圖1）。

2.2 影響不定芽生根的最佳條件

火焰衛(wèi)矛不定芽經過不同生根培養(yǎng)基Ⅰ的根原基誘導后，在生根培養(yǎng)基Ⅱ上培養(yǎng)4 周，觀察不定芽的生根情況，發(fā)現處理2 的生根數最多，且根系粗壯（圖2A）。在階段Ⅰ不同濃度的蔗糖、IBA、NAA 及處理時間下，不定芽生根率、平均生根數及平均根長均存在較大變化幅度（表2）。經SPSS 方差分析，蔗糖對生根率影響極顯著（P＜0.01），其他因素對其影響不顯著；蔗糖對平均生根數具有極顯著影響（P＜0.01），IBA 濃度對其具有顯著影響（P＜0.05）；IBA 對平均根長有極顯著影響（P＜0.01），誘導時間對其有顯著影響（P＜0.05）。經均值比較，蔗糖濃度為0 時生根率最高；蔗糖濃度為0，IBA 濃度為0.5 或2.0 mg·L-1時生根數最多；IBA 濃度為2.0 mg·L-1，處理時間為21 d 時，平均根長最大。生長素濃度及處理時間不宜過高，當NAA 或IBA濃度為2.0 mg·L-1，處理時間為28 d 時，火焰衛(wèi)矛組培苗生長狀況差，并出現葉色變紅（圖2B）。

表1 培養(yǎng)基不同成分對火焰衛(wèi)矛莖段增殖的影響?Table 1 Effect of different components of culture medium on stem proliferation of Euonymus alatus

圖1 火焰衛(wèi)矛的不定芽擴繁Fig.1 The propagation of adventitious bud in Euonymus alatus cv.‘Compacta’

生根階段Ⅰ培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)基強度對生根影響的數據統(tǒng)計分析結果表明（表3），兩者對生根率均沒有顯著影響；培養(yǎng)基類型對平均生根數和平均根長具有顯著影響（P＜0.05）。均值比較發(fā)現，WPM 更適于火焰衛(wèi)矛生根培養(yǎng)。

綜上所述，火焰衛(wèi)矛不定根誘導的最佳生根培養(yǎng)基Ⅰ為1/4 WPM+IBA 2.0 mg·L-1，處理時間為21 d。此時的生根率為96.7 %。

通過統(tǒng)計不定芽在不同蔗糖濃度生根培養(yǎng)基Ⅱ中的生根情況，發(fā)現隨著蔗糖濃度的增加，平均生根數及平均根長先增加后減少，當蔗糖濃度為10 g·L-1時，平均生根數及平均根長最大，平均生根數為2.73 個，平均根長為3.41 cm（表4）。經SPSS 分析，蔗糖濃度對生根數具有極顯著影響（P＜0.01），對平均根長具有顯著影響（P＜0.05），對生根率沒有顯著影響。

圖2 火焰衛(wèi)矛的不定根誘導Fig.2 The induction of adventitious root in Euonymus alatus cv.‘Compacta’

表2 生根階段Ⅰ蔗糖、NAA、IBA 及時間對生根的影響Table 2 Effect of sucrose, NAA, IBA and treating time on rooting at stage Ⅰ

表3 生根階段Ⅰ培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)基強度對生根的影響Table 3 Effect of medium type and medium strength on rooting at stage Ⅰ

表4 生根階段Ⅱ蔗糖對生根的影響Table 4 Effect of sucrose on rooting at stage Ⅱ

2.3 生根小植株頂芽休眠解除與移栽馴化

火焰衛(wèi)矛不定芽生根形成的小植株有頂芽休眠現象，將其置于4 ℃條件下處理3 個月后，93.33%的小植株解除休眠，頂芽迅速伸長（圖3A～B）。芽休眠解除的火焰衛(wèi)矛組培苗，經過移栽、煉苗后，統(tǒng)計移栽成活率。以珍珠巖為移栽基質，成活率為98.89±1.92%；以珍珠巖∶草炭土=1∶1 為移栽基質，成活率為84.44±5.09%?；鹧嫘l(wèi)矛組培苗移栽成活的關鍵在于控制空氣濕度與土壤透氣性，以避免地上部分干枯、地下部分腐爛。因此，在火焰衛(wèi)矛組培苗移栽過程中，宜選擇珍珠巖作為移栽基質，提供基質透氣性，并在煉苗初期以塑料膜覆蓋，保持空氣濕度。待移栽苗長出新葉后，栽種于北京田間，長勢健壯（圖3E）。田間的火焰衛(wèi)矛植株在秋季葉色變紅，可安全越冬（圖3F）。

圖3 火焰衛(wèi)矛生根組培苗的芽休眠解除、馴化、移栽Fig.3 The bud dormancy release, acclimatization and transplantation in Euonymus alatus cv.‘Compacta’

3 討 論

迄今為止，國際公開發(fā)表的培養(yǎng)基已達數百種，而目前用于火焰衛(wèi)矛的培養(yǎng)基主要為MS 及WPM 兩種，且尚無研究表明哪種培養(yǎng)基更為適宜。本研究分析了4 種不同培養(yǎng)基對火焰衛(wèi)矛增殖系數的影響，發(fā)現相較于MS 培養(yǎng)基和B5 培養(yǎng)基，WPM 培養(yǎng)基及DKW 培養(yǎng)基更適宜火焰衛(wèi)矛不定芽增殖。楊秀平等對常用的14 種植物培養(yǎng)基進行了成分數據分析，并聚類分成四類：高無機鹽培養(yǎng)基、高硝酸鉀培養(yǎng)基、中等無機鹽培養(yǎng)基及低無機鹽培養(yǎng)基[17]。適用于火焰衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的WPM 培養(yǎng)基和DKW 培養(yǎng)基同屬于低無機鹽培養(yǎng)基，而MS 培養(yǎng)基和B5 培養(yǎng)基則分屬于高無機鹽培養(yǎng)基和高硝酸鉀培養(yǎng)基。這說明火焰衛(wèi)矛更適宜培養(yǎng)于低無機鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為植物的生長提供營養(yǎng)和環(huán)境條件，不同物種所需營養(yǎng)組成、滲透水勢等不同。過高的無機鹽濃度，將導致細胞脫水，影響細胞的正常分裂分化；而過低的無機鹽濃度無法滿足細胞生長分化所需的物質，亦會導致組織生長分化緩慢。這也為火焰衛(wèi)矛近緣種的培養(yǎng)基選擇提供參考。

蔗糖的最佳濃度在火焰衛(wèi)矛組織培養(yǎng)不同階段存在很大差異。在不定芽增殖過程中，蔗糖的最佳濃度為30 g·L-1；在生根Ⅰ階段，蔗糖最佳濃度為0；生根Ⅱ階段時，蔗糖濃度為10 g·L-1。由于離體培養(yǎng)的外植體很難通過光合作用完成自養(yǎng)，培養(yǎng)基中的糖類便成為外植體的重要能量來源[18]。因此在不定芽培養(yǎng)過程中，添加較高濃度的蔗糖，可為不定芽生長分化提供所需能量，促進不定芽增殖；但當蔗糖濃度過高時，培養(yǎng)基滲透壓太大，將抑制不定芽生長。在不定根誘導過程中，蔗糖亦為外植體的生根誘導提供所需能量。在洋蘭一步法誘導不定根過程中，較高濃度的蔗糖可發(fā)揮積極作用，促進根系誘導發(fā)育[19]。但在火焰衛(wèi)矛二步法誘導不定根過程中，生根階段Ⅰ不添加蔗糖更有利于不定根誘導。這與鐵核桃組培苗二步法生根相似，即第一步在含IBA 的1/4 DKW 培養(yǎng)基中誘導根原基形成，第二步在含活性炭和蔗糖20 g·L-1的1/4 DKW 培養(yǎng)基中促進根原基生長[20]。綜上所述，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度可調節(jié)不定芽增殖與不定根誘導的進程，且在不同物種的不同階段蔗糖用量并不相同。因此，在植物微型快繁體系的建立中，應當將蔗糖濃度作為一項重要的影響因素，予以優(yōu)化。

在火焰衛(wèi)矛組培苗微型快繁過程中，組培苗的不定根誘導通常會導致芽休眠的發(fā)生。芽休眠現象在水仙、百合的不定芽增殖及牡丹的不定根誘導中亦有發(fā)生[21-23]。芽休眠作為落葉植物的一種保護機制，對于植物度過不利環(huán)境具有重要作用。但在植物組織培養(yǎng)中，芽休眠延緩生長分化和移栽馴化進程。雖然通過低溫處理解除芽休眠可使絕大多數休眠芽恢復生長，但需消耗大量時間、處理設備和空間，制約了組培苗微型快繁的速度。本實驗室采用低溫與赤霉素聯合處理的方法，將芽休眠組培苗接種于含GA332 mg·L-1的生根培養(yǎng)基Ⅱ上，置于4 ℃冰箱內低溫處理，45 d后芽休眠解除率可達83.3%（數據未發(fā)表）。此方法的芽休眠解除率雖低于低溫處理的93.33%，但所需時間僅為前者的一半，具有一定的生產價值。若希望進一步消除芽休眠對植物微型快繁的消極影響，今后的研究需闡明芽休眠產生及解除的具體分子機制，獲得調控芽休眠發(fā)生與解除的關鍵基因，并利用轉基因技術抑制芽休眠相關基因表達或促進芽休眠解除相關基因持續(xù)表達，獲得無芽休眠的微型快繁新品種。

研究培養(yǎng)基成分對火焰衛(wèi)矛不定芽增殖及不定根誘導的影響，可以為火焰衛(wèi)矛的工廠化大規(guī)模生產提供理論依據與技術支持。但組培苗工廠化的最大制約因素是生產成本，而生產成本主要由培養(yǎng)基成本、培養(yǎng)基配制成本、接種及培養(yǎng)成本、洗滌成本、移栽成本、儀器設備折舊費、房屋使用費等成本組成。本研究所使用的培養(yǎng)基為商業(yè)化混合培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成本高；同時固體培養(yǎng)基配制、組培苗的接種及培養(yǎng)成本也比較高，這些因素均需進一步優(yōu)化。如果以特定的天然營養(yǎng)源（如馬鈴薯、大豆等）等為基礎，加入適當成分如生長調節(jié)劑構成適合火焰衛(wèi)矛微型快繁的半合成培養(yǎng)基，并形成在液體培養(yǎng)基（組織培養(yǎng)連續(xù)系統(tǒng)）中擴繁生根，可降低成本進行工廠化生產。

4 結 論

本研究以火焰衛(wèi)矛組培苗為材料，探究了培養(yǎng)基不同成分對火焰衛(wèi)矛不定芽增殖及不定根誘導的影響，并發(fā)現火焰衛(wèi)矛不定芽增殖的最佳培養(yǎng) 基 為DKW+6-BA 4.0 mg·L-1+ IBA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，繁殖系數為3.73；最佳生根培養(yǎng)基Ⅰ為1/4 WPM+IBA 2.0 mg·L-1；最佳生根培養(yǎng)基Ⅱ為1/4 WPM+蔗糖10 g·L-1+活性炭2.0 g·L-1，生根率可達98.89%。研究結果為火焰衛(wèi)矛相關研究提供組織培養(yǎng)技術基礎，為提升良種苗木生產提供技術保障。