施他寧緩解急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞線粒體損傷的研究

徐蒙 崔青 李順樂 馬建倉 陳熹 任一凡

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，西安 710004；2西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710003

AP的發(fā)病常伴隨著線粒體功能的紊亂，而線粒體功能紊亂可導(dǎo)致多種組織器官功能異常[1-2]。以往研究證實(shí)，減輕線粒體功能的損傷可以有效地緩解肝臟缺血再灌注損傷的程度[3]。施他寧是一種有效緩解急性胰腺炎癥狀的生長抑素，因顯著的治療效果而被廣泛地應(yīng)用于臨床，但其對胰腺腺泡細(xì)胞的作用機(jī)制仍未可知。本研究旨在探討施他寧對AP相關(guān)胰腺腺泡細(xì)胞線粒體損傷的影響，為闡明施他寧的藥理機(jī)制提供新的思路。

材料與方法

一、動物模型建立及分組

24只雄性C57BL/6小鼠(體重18～22 g)購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心，標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。將24只小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、AP組及AP+施他寧治療組(施他寧組)，每組8只。實(shí)驗(yàn)程序均符合國際實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南，并獲得西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。AP組采用腹腔注射20%左旋精氨酸(4.0 g/kg，美國Sigma公司)，1 h后再次注射相同劑量左旋精氨酸的方法制備AP模型；施他寧組在制模后2 h腹腔注射0.4 mg/kg施他寧(瑞士Serono公司)；對照組小鼠腹腔注射等容積生理鹽水。首次精氨酸注射后72 h處死小鼠，眼眶取血，剖腹取胰腺。

二、觀察指標(biāo)

1．胰腺組織病理學(xué)檢查：胰腺組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察胰腺組織的損傷程度，并根據(jù)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、出血和壞死程度進(jìn)行進(jìn)行病理評分[4]。

2．血清淀粉酶和脂肪酶檢測：應(yīng)用血清淀粉酶和脂肪酶檢測試劑盒檢測各組小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的水平。試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，具體操作方法參照說明書。

3．血清IL-6、IL-10、TNF-α水平檢測：采用ELISA法檢測血清IL-6、IL-10、TNF-α水平。試劑盒均購自武漢云克隆公司，檢測步驟參照說明書。

4．胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體檢測：采用Mitotracker紅色熒光標(biāo)記法觀察線粒體的損傷情況。胰腺組織做冰凍切片，應(yīng)用Mitotracker染料進(jìn)行染色。胰腺腺泡細(xì)胞的線粒體會被Mitotracker染料標(biāo)記為紅色，損傷加重的線粒體熒光強(qiáng)度會減弱。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，每張切片400倍下隨機(jī)拍3張視野，并用imageJ Pro軟件對各組熒光照片定量。

5．胰腺組織ND-3蛋白表達(dá)量檢測：采用常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測ND-3蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗鼠ND-3一抗購自美國ABCAM公司，工作濃度1∶1 000，羊抗兔IgG-HRP二抗購自中國碧云天公司，工作濃度1∶5 000。最后ECL發(fā)光，X片曝光顯影、定影。應(yīng)用凝膠成像儀掃描蛋白條帶，并用儀器自帶的Image J軟件進(jìn)行條帶灰度的定量分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。

6．胰腺組織線粒體融合蛋白2(mitofusion2，Mfn2)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)蛋白檢測：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測胰腺組織Mfn-2、TFAM蛋白表達(dá)量。兔抗鼠Mfn2單克隆抗體(美國CST公司)工作濃度1∶1 000，兔抗鼠TFAM抗體(美國ABCAM公司)工作濃度1∶1 000，二抗1∶5 000。光鏡下觀察3處不同的視野，深棕色染色區(qū)域?yàn)榈鞍钻栃员磉_(dá)區(qū)域，應(yīng)用Image J pro軟件對陽性面積進(jìn)行定量。

7．胰腺組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平檢測：用組織破碎儀制備胰腺組織勻漿，采用SOD、GSH試劑盒檢測SOD、GSH活性；采用脂質(zhì)過氧化工具包檢測MDA水平。試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司，按說明書操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、施他寧減輕AP小鼠胰腺組織損傷

對照組小鼠胰腺組織無明顯病理改變；AP組小鼠胰腺組織明顯水腫、出血和壞死；施他寧組胰腺組織水腫、出血和炎癥細(xì)胞浸潤程度較AP組明顯減輕，壞死面積明顯減少(圖1)。對照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺病理評分分別為(0.47±0.31)、(3.93±0.64)、(2.07±0.50)分，AP組顯著高于對照組，施他寧組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，表明施他寧可以有效地減輕AP胰腺的損傷程度。

對照組、AP組、施他寧組小鼠血清淀粉酶水平分別為(1 094±250)、(1 832±86)、(1 493±172)U/L；脂肪酶水平分別為(237.0±96.8)、(671.0±164.5)、(225.4±83.2)U/L，AP組顯著高于對照組，施他寧組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，表明施他寧能有效地減少胰腺腺泡細(xì)胞的壞死。

二、施他寧緩解AP小鼠的全身炎癥反應(yīng)

對照組、AP組、施他寧組小鼠血清IL-6水平分別為(55.88±13.53)、(358.60±139.22)、(99.09±36.65)ng/L；TNF-α分別為(20.39±4.56)、(40.83±1.62)、(22.75±11.24)ng/L；IL-10分別為(17.48±7.05)、(9.92±8.73)、(15.12±5.03)ng/L。AP組IL-6、TNF-α水平顯著高于對照組，施他寧組顯著低于AP組；AP組的IL-10水平顯著低于對照組，施他寧組顯著高于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示施他寧可以有效地抑制促炎因子，升高抑炎因子，從而減輕炎癥反應(yīng)。

三、施他寧減輕AP小鼠胰腺細(xì)胞線粒體的損傷

對照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織Mitotracker相對熒光密度分別為107.67±17.62、40.00±10.15、71.67±17.62(圖2)，AP組小鼠胰腺細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較對照組減少約60%，而施他寧較AP組的線粒體數(shù)量增加約40%。代表線粒體數(shù)量的ND-3蛋白在對照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織的表達(dá)量分別為1.02±0.12、0.11±0.05、0.45±0.16，AP組ND-3蛋白表達(dá)量顯著低于對照組，施他寧組顯著高于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示施他寧可以增加AP時胰腺腺泡細(xì)胞的線粒體數(shù)量。

圖2 對照組(1)、AP組(2)、施他寧組(3)小鼠胰腺腺泡細(xì)胞線粒體數(shù)量(2A～2C：Mitrotracker染色；2D～2F：細(xì)胞核；2G～2I：融合圖)

四、施他寧保護(hù)AP小鼠胰腺細(xì)胞線粒體的功能

對照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織TFAM表達(dá)量分別為100%、54%、78%；Mfn-2蛋白表達(dá)量分別為100%、47%、86%(圖3)，AP組較對照組顯著減少，施他寧組較AP顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示AP時胰腺腺泡細(xì)胞線粒體發(fā)生和融合的功能受損，施他寧可以有效增加TFAM和Mfn-2蛋白的表達(dá)。

五、施他寧緩解AP小鼠胰腺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)

對照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺組織MDA分別為(2.90±0.17)、(7.33±2.08)、(5.00±1.73)nmol/mg蛋白；SOD水平分別為(21.33±4.04)、(8.67±2.07)、(17.33±3.21)U/mg蛋白；GSH分別為(143.33±12.01)、(77.33±29.69)、(131.33±20.55)U/mg蛋白。AP組MDA顯著高于對照組，施他寧組顯著低于AP組；AP組SOD、GSH顯著低于對照組，施他寧組顯著高于AP 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示施他寧有效緩解了AP時胰腺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖3 對照組、AP組、施他寧組小鼠胰腺腺組織Mfn-2(3A～3C)和TFAM(3D～3F)蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

討 論

AP發(fā)生時，胰腺組織局部的損傷壞死所造成的腺泡細(xì)胞內(nèi)容物外漏可以引起炎癥遞質(zhì)釋放，不斷加劇的胰腺組織損傷引起炎癥遞質(zhì)大量激活并釋放入血可以引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征[5]，造成多個遠(yuǎn)隔器官損傷并最終導(dǎo)致患者死亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，施他寧不僅可以緩解AP小鼠胰腺組織炎癥細(xì)胞的浸潤，更可以下調(diào)血清中IL-6、TNF-α等炎癥遞質(zhì)的水平從而減輕全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AP病情的局限以及轉(zhuǎn)歸。線粒體損傷在AP的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[7]。Mukherjee等[8]最近的一項(xiàng)研究表明，在左旋精氨酸誘導(dǎo)的AP中，高淀粉酶血癥、胰蛋白酶原激活、壞死、空泡化和炎癥都是因線粒體功能障礙介導(dǎo)的線粒體損傷所造成的。正常的線粒體功能離不開線粒體正確的發(fā)生以及穩(wěn)定的融合[3]，TFAM蛋白和Mfn-2蛋白分別代表了線粒體發(fā)生以及線粒體融合水平，線粒體損傷不僅造成線粒體數(shù)目的減少，同樣造成線粒體功能的改變[1]。

本課題組前期的研究已經(jīng)證實(shí)，線粒體數(shù)目和功能的損傷在AP的發(fā)病進(jìn)程中處于核心位置，線粒體功能受損可以引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，施他寧不僅可以保護(hù)胰腺腺泡細(xì)胞線粒體的數(shù)目，并且可以恢復(fù)降低的Mfn-2以及TFAM蛋白的水平，這說明施他寧可以在保護(hù)線粒體數(shù)目的同時，避免線粒體發(fā)生和融合的功能受到損害。在AP小鼠模型中，線粒體功能障礙可能是由鈣超載或非鈣超載機(jī)制引起的[8]。左旋精氨酸通過抑制F-ATP合酶的活性，即非鈣超載途徑誘導(dǎo)AP的發(fā)生[9]。本研究結(jié)果證實(shí)施他寧在非鈣依賴AP小鼠模型中是有益的，這表明它有可能用于治療非鈣離子超載導(dǎo)致的AP的患者。

線粒體損傷不僅可以造成胰腺腺泡細(xì)胞能量供應(yīng)障礙，也可以進(jìn)一步地引起細(xì)胞氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10]，氧化應(yīng)激的持續(xù)存在可以反過來加重線粒體功能的紊亂，加速胰腺腺泡細(xì)胞的損傷和壞死[11]。線粒體功能紊亂所造成的能量失衡，伴隨細(xì)胞過氧化造成的細(xì)胞器損傷，可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)多種功能蛋白的錯誤折疊和組合，進(jìn)一步加重胰腺腺泡細(xì)胞功能的喪失。嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以誘發(fā)凋亡相關(guān)蛋白CHOP的表達(dá)升高，介導(dǎo)活化下游的Caspase 3以及BAX等凋亡相關(guān)基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[7,12]。本研究結(jié)果顯示施他寧同時可以緩解AP小鼠胰腺組織的氧化應(yīng)激水平，更進(jìn)一步減輕了AP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞的損傷程度，緩解了AP病情。

綜上所述，施他寧可以緩解AP小鼠胰腺腺泡細(xì)胞中線粒體功能以及數(shù)目的損傷和減少，進(jìn)而減輕胰腺組織氧化應(yīng)激的水平，并最終保護(hù)受損的胰腺組織，改善全身炎癥反應(yīng)的情況。但是施他寧改善胰腺腺泡細(xì)胞線粒體功能的具體作用靶點(diǎn)目前尚未可知，本課題組將更進(jìn)一步地探索施他寧保護(hù)線粒體功能的具體分子機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突