二代測序在胰腺癌中的應(yīng)用

楊野梵 翟博雅 龔予希 張響 張智弘

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南京 210029

【提要】 胰腺癌病死率高，5年生存率僅有8%。PDAC占所有胰腺惡性腫瘤約90%，早期診斷困難，手術(shù)切除是其唯一可能的治愈方法，治療方式一直缺少突破性進(jìn)展。二代測序(NGS)可以發(fā)現(xiàn)PDAC的突變基因，運(yùn)用NGS的PDAC分子分型提出了PDAC的潛在治療靶點(diǎn)和發(fā)生機(jī)制。NGS還可以應(yīng)用于生物標(biāo)志物的檢測，有助于早期診斷和術(shù)后隨訪。對(duì)患者進(jìn)行NGS檢測可以對(duì)藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，提供個(gè)體化治療的可能。

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，5年生存率僅為8%[1]。 2018年的癌癥新發(fā)病例中，胰腺癌排名第14位，所導(dǎo)致的死亡排名為第7位[2]。PDAC約占所有胰腺惡性腫瘤的90%，導(dǎo)致其病死率高的原因包括早期診斷困難、缺乏特異性高的生物標(biāo)志物、發(fā)現(xiàn)時(shí)通常已處于晚期而缺乏有效的治療手段等。家族中存在至少兩名患有PDAC的一級(jí)親屬者患胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)幾乎是正常人的兩倍，多種遺傳性疾病也會(huì)增加患PDAC的風(fēng)險(xiǎn)[3]。近年來，通過廣泛應(yīng)用二代測序(next-generation sequencing, NGS)中的全基因組測序和全外顯子組測序，發(fā)現(xiàn)了胰腺腫瘤中的許多基因突變和潛在的治療位點(diǎn)。

一、NGS在胰腺癌早期診斷和預(yù)后中的應(yīng)用

對(duì)于有胰腺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的人群，指南[4]推薦可以通過NGS檢測家族性胰腺癌易感基因BRCA2、PALB2、STK11、ATM、PRSS1等和家族性非典型多發(fā)黑色素瘤痣綜合征的p16種系突變、遺傳性結(jié)腸癌(Lynch綜合征)的MMR基因種系突變、Peutz-Jeghers綜合征的STK11基因種系突變，根據(jù)測序情況判斷是否需要進(jìn)行胰腺腫瘤的篩查。

通過NGS可以發(fā)現(xiàn)能夠早期診斷和提示PDAC預(yù)后的基因。PDAC的4個(gè)散發(fā)性胰腺癌驅(qū)動(dòng)基因(KRAS、CDKN2A的p16位點(diǎn)、TP53和SMAD4的DPC4位點(diǎn))改變的頻率最高，這些基因可以作為靶基因進(jìn)行早期診斷和殘留病灶檢測[5]。此外，Witkiewicz等[6]發(fā)現(xiàn)RBM10突變患者存活時(shí)間延長，ARID1A突變患者預(yù)后不良，攜帶MYC致癌基因的8q24基因座擴(kuò)增與不良預(yù)后相關(guān)。非編碼RNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)或基因表達(dá)沉默，失調(diào)的非編碼RNA可以用作生物標(biāo)志物進(jìn)行早期檢測。研究者通過NGS發(fā)現(xiàn)了許多microRNA和lncRNA在PDAC組和對(duì)照組之間存在差異表達(dá)。其中miR-802在PDAC中顯著下調(diào)，miR-93在導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤(intraductal papillary mocinous neoplasm, IPMN)中顯著上調(diào)[7-8]。

NGS可用于體液標(biāo)本檢測，達(dá)到無創(chuàng)檢查的目的。Yu等[9]對(duì)115例包括健康者及PDAC、IPMN患者在內(nèi)的受試者的胰液樣本進(jìn)行數(shù)字NGS檢測，發(fā)現(xiàn)PDAC患者胰液中更容易檢測到TP53和(或)SMAD4突變，并且此類突變未在對(duì)照組中檢測到。突變體TP53和SMAD4濃度可區(qū)分PDAC與IPMN病例，靈敏度為32.4%，特異度為100%。值得注意的是，有兩例患者在胰腺癌診斷前1年內(nèi)收集的胰液樣本中檢測到TP53或SMAD4突變，但影像學(xué)并未檢測到可疑的病變。同樣是基于胰液樣品的NGS分析，Kisiel等[10]從表觀遺傳學(xué)水平上檢測DNA甲基化。他們發(fā)現(xiàn)甲基化CD1D對(duì)檢測PDAC靈敏且特異，性能優(yōu)于突變型KRAS。胰液中的甲基化標(biāo)志物水平不受年齡、性別、癌癥階段或部位的影響。另一項(xiàng)基于手術(shù)切除標(biāo)本的DNA甲基化測序研究發(fā)現(xiàn)CpG位點(diǎn)的甲基化與患者存活率相關(guān)，F(xiàn)AM150A、ONECUT1、RASSF10等基因甲基化也與患者存活率增加有關(guān)，有作為生物標(biāo)志物的潛能[11]。相較于組織活檢，對(duì)血液中循環(huán)游離DNA(circulating free DNA, cfDNA)分離后進(jìn)行NGS分析，可降低成本，且可以通過常規(guī)抽血，監(jiān)測腫瘤導(dǎo)致的基因突變的數(shù)量和性質(zhì)。對(duì)于未獲得足夠NGS的腫瘤組織的患者，使用cfDNA的NGS可檢測到活檢樣本90.3%基因突變，診斷準(zhǔn)確率為97.7%[12]。研究表明循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是晚期PDAC的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，預(yù)示手術(shù)切除患者無病生存期較短[13]。

NGS作為早期診斷手段，被證明在某些方面優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。大約一半的胰腺囊腫是腫瘤性的，黏液性胰腺囊腫如IPMN和黏液性囊性腫瘤(mucinous cystic neoplasm, MCN)可以發(fā)展為浸潤性胰腺導(dǎo)管腺癌[14]，但影像學(xué)方法在診斷囊腫性質(zhì)方面存在局限性。Singhi等[15]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，分別用NGS和Sanger測序分析來自595例患者的626個(gè)胰腺囊腫液樣本，發(fā)現(xiàn)NGS檢測黏液性胰腺癌的KRAS和(或)GNAS突變具有89%的靈敏度和100%的特異度，高于Sanger測序65%的靈敏度和100%的特異度。NGS聯(lián)合檢測KRAS/GNAS和TP53/PIK3CA/PTEN，對(duì)胰腺癌進(jìn)展的診斷靈敏度可達(dá)89%，特異度達(dá)100%。2019年的一項(xiàng)薈萃研究比較胰腺囊腫手術(shù)患者囊腫液的NGS基因檢測和微切片活檢的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)對(duì)于惡性和高風(fēng)險(xiǎn)的黏液囊腫，NGS基因檢測的診斷準(zhǔn)確性高于微切片活檢[16]。

二、NGS在胰腺癌分子分型中的應(yīng)用

研究表明，腫瘤的分子差異可以決定患者預(yù)后和治療效果。Collisson等[17]提出將PDAC分為3種分子亞型：經(jīng)典型、類間充質(zhì)型和外分泌型。Bailey等[18]使用RNAseq將PDAC按照分子病理和潛在機(jī)制分為4型：鱗型(squamous)、胰腺祖細(xì)胞型(panreatic progenitor)、免疫源型(immunogenic)和內(nèi)外分泌異常分化型。鱗型富含TP53和KDM6A突變，預(yù)后較其他類型差。胰腺祖細(xì)胞型表達(dá)包括PDX1、MNX1、HNF4G、FOXA2等影響胰腺內(nèi)皮細(xì)胞分化和導(dǎo)致青少年的成人起病型糖尿病的基因。免疫源型表現(xiàn)為免疫網(wǎng)絡(luò)水平總體上調(diào)。內(nèi)外分泌異常分化型表現(xiàn)為影響腺泡細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞分化的基因表達(dá)上調(diào)。除免疫源型為新發(fā)現(xiàn)型別，其余3型與Collisson提出的上述3型重合，鱗型對(duì)應(yīng)類間充質(zhì)型，胰腺祖細(xì)胞型對(duì)應(yīng)經(jīng)典型，內(nèi)外分泌異常分化型對(duì)應(yīng)外分泌型。分子分型可參與預(yù)后判斷，一項(xiàng)對(duì)518例患者的NGS數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，胰體尾腫瘤患者的生存率明顯低于胰頭腫瘤患者，體尾部腫瘤與PDAC的鱗型亞型相關(guān)，鱗型亞型患者肝臟復(fù)發(fā)率高，分化差，腫瘤級(jí)別高[19]。Waddell等[20]對(duì)100 例PDAC患者進(jìn)行全基因組測序和拷貝數(shù)變異分析，根據(jù)染色體結(jié)構(gòu)變化和結(jié)構(gòu)變異事件數(shù)量將PDAC分為4型：穩(wěn)定型、局部重排型、分散型和不穩(wěn)定型。結(jié)果表明局部重排型且包含治療靶點(diǎn)局灶擴(kuò)增(如ERBB2、FGFR)腫瘤的患者，以及不穩(wěn)定型的具有DNA損傷應(yīng)答缺陷的患者可能對(duì)鉑和聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase, PARP)抑制劑敏感。

三、NGS在胰腺癌治療中的應(yīng)用

PDAC的NGS分子分型雖然尚處于起步階段，但近年來已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，為研究PDAC的治療提供了幫助。加拿大的COMPASS試驗(yàn)通過全基因組測序和RNA測序，使用經(jīng)典型與基底樣亞型的分子分型方案[21]，發(fā)現(xiàn)基底樣型對(duì)一線化療反應(yīng)較差[22]。根據(jù)不同分子亞型突變基因的差異，篩選有藥物治療靶點(diǎn)的突變基因，對(duì)患者進(jìn)行個(gè)性化治療。具有種系BRCA基因突變和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者維持奧拉帕尼(PARP抑制劑)的無進(jìn)展生存期延長[23]，鉑暴露的晚期BRCA相關(guān)的PDAC患者的總體生存率提高[24]。針對(duì)KRAS的關(guān)鍵下游信號(hào)(如RAF)的藥物對(duì)PDAC治療有效，使用YAP抑制劑和LY3009120(泛RAF抑制劑)對(duì)PDAC治療顯示出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤效果[25]。Brauswetter等[26]提出將KRAS突變中的G12C突變單獨(dú)作為一型，因?yàn)镵RAS G12C突變和低EGFR表達(dá)患者對(duì)單一MEK抑制劑(曲美替尼)治療敏感，而其余患者聯(lián)合治療更加有效。Waddle等[20]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制基因RNF43在10%的PDAC患者中失活，RNF43負(fù)反饋抑制Wnt/β-catenin通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]，因此RNF43缺失患者可能會(huì)對(duì)Wnt抑制性藥物敏感。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)是由DNA錯(cuò)配修復(fù)序列基因缺失引起的，可在1%～2%的PDAC患者中檢出[28]。美國FDA批準(zhǔn)派姆單抗(PD-1抑制劑) 用于存在MSI的任何實(shí)體腫瘤的一線治療。常規(guī)可通過免疫組化檢測錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和(或)PMS2的丟失來鑒定MSI，但是免疫組化受組織固定、染色以及可用組織的限制較大。NGS允許同時(shí)對(duì)MSI位點(diǎn)進(jìn)行全面研究，顯示突變負(fù)荷在PDAC中不均勻分布。因此Hu等[29]建議對(duì)轉(zhuǎn)移性或局部晚期PDAC患者，將NGS作為主要診斷檢測MSI，以評(píng)估是否使用免疫療法。

有研究者將NGS與基于證據(jù)的新型軟件工具(治療圖)結(jié)合，生成用于PDAC化療方案的個(gè)體化分析[30]。軟件基于對(duì)原始測序數(shù)據(jù)的分析檢測患者腫瘤的遺傳改變，自動(dòng)搜索先前發(fā)表的遺傳改變的臨床意義，生成治療圖。將分析結(jié)果與患者實(shí)際化療結(jié)果進(jìn)行比較。整個(gè)分析可在2周內(nèi)完成，可用于臨床常規(guī)。這些結(jié)果表明基于NGS的軟件分析數(shù)據(jù)可以提供有效、無效和有毒藥物的循證信息，可能成為PDAC精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)。

四、NGS在胰腺癌中對(duì)罕見基因的發(fā)現(xiàn)及對(duì)治療的探索

Biankin等[31]對(duì)142例PDAC患者進(jìn)行全外顯子組測序后發(fā)現(xiàn)，除了已知在PDAC中發(fā)生突變的基因KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1，還新發(fā)現(xiàn)包括參與染色質(zhì)修飾的基因EPC1和ARID2的突變，以及體細(xì)胞突變基因ATM。ATM基因首先由Roberts等[32]通過NGS在家族性胰腺癌中報(bào)道。Waddell等[20]對(duì)100 例PDAC患者進(jìn)行全基因組測序后發(fā)現(xiàn)，最常見的PDAC突變基因分別是KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A，他們還發(fā)現(xiàn)另外兩個(gè)首次在PDAC中報(bào)道的基因KDM6A和PREX2。Witkiewicz等[6]對(duì)109例PDAC進(jìn)行全外顯子組測序，首次發(fā)現(xiàn)包括BCLAF1、IRF6、FLG、AXIN1、GLI3和PIK3CA等基因的突變。

家族性胰腺癌(familial pancreatic cancer, FPC)是指患者至少兩名一級(jí)親屬患有胰腺癌，約占PDAC的10%[33]。有PDAC家族史的人與一般人群相比，患PDAC風(fēng)險(xiǎn)增加且發(fā)病年齡提前。了解導(dǎo)致FPC遺傳易感性的基因，可以早期檢測突變攜帶者，為個(gè)性化治療提供機(jī)會(huì)。在NGS被應(yīng)用于PDAC基因檢測前，已發(fā)現(xiàn)BRCA1、BRCA2等基因在FPC的突變。FPC中最常見的突變基因是BRCA2，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物是PALB2蛋白的結(jié)合配體。Jones等[34]對(duì)96例FPC患者進(jìn)行全外顯子組測序后在3例患者中發(fā)現(xiàn)了PALB2短縮突變，而1 084名健康者均沒有攜帶此突變，表明PALB2是FPC中第二常見的突變基因，這可能為PDAC的發(fā)病機(jī)制研究提供新思路。Roberts等[35]對(duì)638例FPC患者進(jìn)行了全基因組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BUB1B、CPA1、FANCC、FANCG、ASXL1、DNMT3A和TET2的有害變異在FPC患者中更常見。這些候選基因有許多參與調(diào)節(jié)DNA修復(fù)或染色體穩(wěn)定性。

PDAC與糖尿病之間的雙向相互作用已經(jīng)通過流行病學(xué)研究得到證實(shí)，對(duì)26例無糖尿病的PDAC患者和6例合并糖尿病PDAC患者的NGS分析發(fā)現(xiàn)13個(gè)突變基因(PIK3CD、SNCAIP、IRF4、HLA-A、NOTCH4、PIM1、ETV6、B2M、CD70、PRDM14、TGFBR1、FLT1和PARP2)僅出現(xiàn)在糖尿病組中，主要參與免疫相關(guān)通路，可能為探索糖尿病PDAC患者免疫治療提供新思路[36]。

五、小結(jié)

NGS現(xiàn)在廣泛運(yùn)用于基因檢測、診斷和治療中，可檢測的標(biāo)本多樣。應(yīng)用NGS技術(shù)觀察到PDAC中許多種系和體細(xì)胞基因突變，通過對(duì)PDAC進(jìn)行分子分型，發(fā)現(xiàn)了許多生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。NGS可以提供海量的數(shù)據(jù)，但是仍受讀長的限制，質(zhì)量有待提高，盡管長讀長測序可以克服NGS的這一大弱點(diǎn)，但成本相對(duì)較高并且通量較低[37]，NGS同時(shí)還和其他的技術(shù)之間存在競爭。隨著NGS技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將更有助于PDAC的診斷和治療并最終改善患者的預(yù)后。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突