兩類破壁靈芝孢子粉三萜的提取工藝優(yōu)化及其含量測定

溫艷艷 張靜 朱雅琴

摘要 [目的]優(yōu)化CO2超臨界萃取孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘渣和破壁靈芝孢子粉中三萜類成分提取工藝以及CO2超臨界萃取孢子油前后三萜類成分的含量差異。[方法]通過設(shè)計正交試驗，采用紫外-可見分光光度法測量提取液的吸光度，計算提取率，根據(jù)正交數(shù)據(jù)分析，確定最佳提取方案以及含量差異。[結(jié)果]對于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉來說，最佳提取工藝為以無水乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶30（g∶mL），提取時間為2 h，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)為4次時提取率最高;對于破壁靈芝孢子粉來說，最佳提取工藝為以無水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時間為1.5 h，提取溫度為50 ?℃，提取次數(shù)2次時提取率最高;且二者三萜類成分含量存在于有明顯差異。[結(jié)論]該研究為進一步分析破壁靈芝孢子粉在CO2超臨界萃取孢子油前后三萜類成分含量差異提供理論依據(jù)和參考。

關(guān)鍵詞 破壁靈芝孢子粉;提取工藝優(yōu)化;含量測定;方法學(xué)考察;正交試驗設(shè)計;紫外-可見分光光度法

中圖分類號 R284 ?文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）19-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.048

Abstract [Objective]To optimize the extraction process of triterpenoids from the residues of spore powder of Ganoderma lucidum and spores of Ganoderma lucidum after CO2 supercritical extraction of spore oil and the difference of triterpenoids content before and after CO2 supercritical extraction of spore oil.[Method]By designing an orthogonal experiment，the absorbance of the extract was measured by UVvis spectrophotometry，the extraction rate was calculated，and the optimal extraction scheme and content difference were determined based on the orthogonal data analysis.[Result]The best extraction process for the broken Ganoderma lucidum spore powder after CO2 supercritical extraction of Ganoderma lucidum spore oil： absolute ethanol as the extraction solvent，the solidliquid ratio was 1∶30，and the extraction rate was highest when the temperature was 70 ?℃ for 2 h and the number of times was 4 times.For Ganoderma lucidum spore powder，the best extraction process was： using absolute ethanol as the extraction solvent，the solidliquid ratio was 1∶20，the extraction time was 1.5 h，the extraction temperature was 50 ℃，and the extraction rate is the highest;and the content of triterpenoids in the two was significantly different.[Conclusion]The study provides a theoretical basis and reference for further analysis of the content difference of triterpenes in the broken Ganoderma lucidum spore powder before and after CO2 supercritical extraction of spore oil.

Key words Broken Ganoderma lucidum spore powder;Optimization of extraction process;Content determination;Methodological investigation;Orthogonal experimental design;Ultravioletvisible spectrophotometry

基金項目 安徽省科技重大專項（17030801015）。

作者簡介 溫艷艷（1995—），女，安徽濉溪人，碩士研究生，研究方向：藥學(xué)。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事藥物制劑新技術(shù)與藥物體內(nèi)外分析研究。

收稿日期 2020-01-03;修回日期 2020-03-06

靈芝（Ganodermo lucidum）屬于擔(dān)子菌綱多孔菌科真菌，是我國名貴的傳統(tǒng)中藥材，在中國有上千年的藥用歷史，又名“瓊珍”，被歷代醫(yī)藥家視為滋補強壯、扶正固本的神奇珍品[1]。靈芝孢子粉是在靈芝成熟后從菌褶中彈射出來的微小的生殖細胞，也是靈芝的種子，具有靈芝的全部遺傳物質(zhì)，其形態(tài)極其微小（4～6 μm），一般條件下想要自然收集很困難。近年來經(jīng)證實靈芝孢子粉主要具有抗癌抗腫瘤活性[2-4]、保護神經(jīng)系統(tǒng)[5-6]、保肝護肝[7-8]、降血脂[9]、降血糖[10]、調(diào)節(jié)機體免疫力[11-12]等作用。此外，靈芝孢子粉類藥物被廣泛應(yīng)用于臨床方面，且安全無毒。

靈芝三萜一般可以從不同種類的靈芝中分離提純獲得，且靈芝三萜在靈芝中的含量多少常被作為評判靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。1982年，Kubota等[14]首次從靈芝中分離出2種靈芝酸成分，即靈芝酸A、B，目前為止已鑒定出的靈芝三萜的種類達300多種[15]。靈芝三萜類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有高度氧化性的羊毛甾烷衍生物，分子量一般在400～600 Da，脂溶性較高，難溶于水。三萜多數(shù)具有苦味，苦味越強則三萜含量越高，從靈芝子實體、孢子粉、菌絲體等的提取物中分離出多種三萜類成分，大多數(shù)以靈芝酸為主[16]。

破壁靈芝孢子粉價格昂貴，且對于考察靈芝孢子粉的質(zhì)量目前沒有一個確切的科學(xué)評價體系，對于其藥理作用、臨床應(yīng)用以及相關(guān)藥物研發(fā)領(lǐng)域研究等都發(fā)現(xiàn)與其活性成分密切相關(guān)。有研究表明，破壁靈芝孢子粉CO2超臨界萃取孢子油后，其中三萜類成分也會相應(yīng)地被提取出來[17]，為避免資源浪費，對其中剩余三萜類成分進行提取，可以實現(xiàn)資源利用最大化。

應(yīng)要求采用有機溶劑回流提取法對兩類破壁靈芝孢子粉中三萜類成分進行提取，在提取過程中，提取溶劑、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)、料液比等都會對提取率有一定的影響，因此采用正交法對提取方案進行優(yōu)化，正交設(shè)計作為一種高效經(jīng)濟且可以同時對多種影響因素進行考察的試驗設(shè)計方法[18]，可以有效選取對靈芝孢子粉中三萜類成分提取的最優(yōu)影響因素，獲得最佳提取工藝，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，尤其是中藥中有效成分的提取分離。筆者通過紫外-可見分光光度法進行含量測定，比較萃取靈芝孢子油前后三萜類成分含量差異，從而更客觀地評價靈芝孢子粉質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材。

CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘渣、破壁靈芝孢子粉，由黃山云樂靈芝有限公司提供。

1.1.2 試劑。

無水甲醇、無水乙醇、冰醋酸、香草醛、乙酸乙酯，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;高氯酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級純;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度： HPLC≥98%，批號 CHB171229，成都克洛瑪生物科技有限公司。

1.1.3 儀器。

十萬分之一分析天平、千分之一分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國heidolph;恒溫水浴鍋，上海越眾儀器設(shè)備有限公司;紫外-可見分光光度計，UV-8000，上海元析分析儀器有限公司;SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司;抽濾裝置，北京欣維爾玻璃儀器有限公司;全波長掃描儀，德國耶拿分析儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的配制。

精密稱取齊墩果酸對照品10.00 mg，用無水甲醇溶解，配制成0.2 mg/mL的溶液，待用。

1.2.2 供試品溶液的制備。

精密稱量2 g破壁靈芝孢子粉、CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘渣，分別置于500 mL容量瓶中，通過設(shè)計正交試驗，在不同試驗條件下對破壁靈芝孢子粉、CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉殘渣分別進行有機溶劑回流提取三萜類成分，將提取液經(jīng)減壓抽濾，合并濾液，對獲得的澄清濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于70 ℃水浴濃縮至少于25 mL，采用25 mL容量瓶用相應(yīng)的提取溶劑進行定容至25 mL混勻，制得供試品溶液。

1.2.3 最大吸收波長的確定。

精密量取0.6 mL對照品溶液于10 mL試管中，于50 ℃烘箱中揮干，放冷，精密加入0.2 mL香草醛冰醋酸溶液（精密稱量香草醛粉末500 mg，置于10 mL容量瓶中，用冰醋酸配制成50 mg/mL的香草醛冰醋酸溶液）、0.8 mL高氯酸溶液，混勻，于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰浴5 min，精密加入乙酸乙酯4 mL，混勻，制得待測標(biāo)準(zhǔn)品溶液;并用相應(yīng)試劑制備空白溶液，作為參比溶液，利用紫外全波長掃描儀于200～800 nm進行全波長掃描，繪制吸光度-波長曲線，確定最大吸收波長。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 線性關(guān)系考察。分別

精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長處測定吸光度，繪制吸光度（y）與濃度（x）曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.2 精密度。

精密量取對照品溶液0.6 mL，于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長處測定吸光度，重復(fù)測定6次，計算RSD。

1.2.4.3 重復(fù)性。精密量取100 μL CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的供試品溶液、25 μL破壁靈芝孢子粉的供試品溶液，各6份于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長處測定吸光度，計算RSD。

1.2.4.4 穩(wěn)定性。

精密量取100 μL CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的供試品溶液、25 μL破壁靈芝孢子粉的供試品溶液于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長處測定吸光度，每隔10 min測定一次吸光度，測定1 h，自第2小時起，每隔1 h測定一次吸光度，計算RSD。

1.2.4.5 加樣回收率。分別精確吸取已知三萜含量的CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉供試品溶液50 μL于9支10 mL試管中，分成3份，分別加入1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2對照品溶液，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長處測定吸光度，計算回收率和RSD。

分別精確吸取破壁靈芝孢子粉供試品溶液5 μL于9支10 mL試管中，分成3份，按上述方法加入對照品溶液，并同法操作。

1.2.5 靈芝三萜含量測定。

精密量取100 μL CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的供試品溶液、25 μL破壁靈芝孢子粉的供試品溶液于10 mL試管中，自揮干起，按“1.2.3”中同法操作，于最大吸收波長處測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程，計算靈芝三萜的含量。

1.3 正交試驗設(shè)計 該試驗主要采用有機溶劑回流提取，考察提取溶劑（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）、提取次數(shù)（E）5個因素對CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉和破壁靈芝孢子粉中三萜類成分提取率的影響，設(shè)計L16（45）正交試驗，見表1。

1.4 驗證試驗

對正交試驗結(jié)果進行分析，獲得最佳試驗方案，在最佳試驗方案條件下提取破壁靈芝孢子粉、CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉中的三萜類成分，并測定三萜類成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長 從靈芝三萜類成分在200～800 nm的吸光度-波長曲線（圖1）可以看出，靈芝三萜類成分在波長為548 nm處獲得最大吸光度，因此選擇548 nm作為最大吸收波長進行后續(xù)試驗。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察。按“1.2.4.1”操作，計算得出線性回

歸方程y=2.290 2x-0.086 6，R2=0.999 1（n=6），結(jié)果表明三萜濃度在8.00～41.00 μg/mL穩(wěn)定。

2.2.2 精密度。按“1.2.4.2”操作，計算出吸光度的RSD為0.077%（n=6），表明儀器具有較好的精密度。

2.2.3 重復(fù)性。按“1.2.4.3”操作，計算出CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉三萜提取液吸光度的RSD分別為0.253%、1.254%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.4 穩(wěn)定性。按“1.2.4.4”操作，計算出CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉的三萜提取液2 h內(nèi)吸光度的RSD為1.650%，表明在2 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性;破壁靈芝孢子粉三萜提取液在1 h內(nèi)吸光度的RSD為1.157%，表明該方法在1 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.5 加樣回收率。按“1.2.4.5”操作，破壁靈芝孢子粉和CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉三萜提取液加樣回收率結(jié)果見表2、3，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于三萜類成分的測定。

2.3 正交試驗

由表4可知，對于破壁靈芝孢子粉來說，各提取因素對其三萜提取率的影響從大到小依次為A、D、B、E、C，破壁孢子粉三萜最佳提取工藝為A3B1C2D1E2，即無水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20（g∶mL），提取時間1.5 h，提取溫度50 ℃，提取次數(shù)2次。對于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁孢子粉來說，各因素對三萜提取率的影響從大到小依次為B、E、A、D、C，CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉三萜最佳提取工藝為A3B2C3D3E4，即無水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶30，提取時間2.0 h，提取溫度70 ℃，提取次數(shù)4次。

為分析不同影響因素對兩類破壁靈芝孢子粉中三萜類成分提取率影響的顯著性，對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溶劑、料液比、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)對靈芝三萜類成分提取率均具有顯著影響（P<0.05）。對于破壁靈芝孢子粉，提取溶劑對其提取率影響較大;對于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉，料液比是影響其提取率的主要因素。

2.4 驗證試驗

對經(jīng)正交試驗得到的最佳提取工藝進行驗證，得CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉三萜提取率為1.69%，破壁靈芝孢子粉三萜提取率為12.29%，故證明所確定的2種提取工藝為最佳提取工藝。

3 結(jié)論與討論

由方法學(xué)考察結(jié)果可知，采用紫外-可見分光光度法測定靈芝孢子粉中三萜類成分的可行性良好。通過正交試驗考察提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)對兩類破壁孢子粉三萜提取率的影響，發(fā)現(xiàn)在一定程度下不同因素對兩類破壁靈芝孢子粉提取率的影響不盡相同，對于破壁靈芝孢子粉，提取溶劑對其提取率影響較大，且其最佳提取工藝為無水乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶20，提取時間為1.5 h，提取溫度為50 ℃，提取次數(shù)2次;對于CO2超臨界萃取靈芝孢子油后的破壁靈芝孢子粉，料液比是影響其提取率的主要因素，且最佳提取工藝為無水乙醇為提取溶劑，料液比為1∶30，提取時間為2.0 h，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)4次。

目前多數(shù)學(xué)者多采用有機溶劑作為提取溶劑，相對于氯仿、乙酸乙酯來說不同濃度乙醇、甲醇毒性較小，價廉易得，適用于工業(yè)化生產(chǎn)?；亓魈崛【哂刑崛×看?、操作簡單、適用范圍廣等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。設(shè)計正交試驗方案，對各種因素的影響進行綜合考察，進一步縮短試驗時間，減少資源損耗。采用紫外-可見分光光度法進行含量測定，并進行方法學(xué)試驗考察該方法的可靠性，然后根據(jù)試驗中測得的吸光度計算兩類孢子粉中三萜類成分的提取率，比較含量差異，并根據(jù)正交試驗的結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，探討各因素對結(jié)果的影響效果，綜合考察得出最佳提取工藝。

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