綠豆子葉節(jié)離體再生體系優(yōu)化

張勤雪 閆強(qiáng) 袁星星

摘要 以綠豆（Vigna radiata （L.） Wilczek）幼嫩健康的子葉節(jié)為外植體，對(duì)影響其再生的2個(gè)關(guān)鍵因素——綠豆基因型和培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑配比開展篩選試驗(yàn)，建立綠豆子葉節(jié)離體再生體系。在篩選的100份種質(zhì)資源中，8份材料再生效果好，同時(shí)發(fā)現(xiàn)適宜不定芽分化的培養(yǎng)基配方為B5+1.0 ?mg/L 6-BA +1.0 ?mg/L KT+0.1 ?mg/L IBA，適宜不定根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為1/2MS+1 ?mg/L IBA。通過此次試驗(yàn)，初步建立起了適合國內(nèi)應(yīng)用的綠豆子葉節(jié)外植體離體再生體系。

關(guān)鍵詞 綠豆;子葉節(jié);離體;再生體系;優(yōu)化

中圖分類號(hào) S522 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0034-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.009

Abstract Using the young and healthy cotyledon nodes of Vigna radiataas explants，a screening experiment was conducted to establish two key factors （Vigna radiata genotype and medium plant growth regulator ratio） affecting its regeneration，and an in vitro regeneration system of Vigna radiata cotyledon nodes was established.Among the 100 germplasm resources screened，8 materials had good regeneration capacity，and found that the medium suitable for adventitious bud differentiation was B5+1.0 ?mg/L 6-BA+1.0 ?mg/L KT+0.1 ?mg/L IBA;the optimal adventitious rootinducing medium formula was 1/2MS+1 ?mg/L IBA.Through this experiment，an in vitro regeneration system of Vigna radiata cotyledonary explants suitable for domestic production and application was initially established.

Key words Vigna radiata （L.） Wilczek; Cotyledonary node;In vitro;Regeneration system;Optimization

基金項(xiàng)目 國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016YFE0203800）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31871696）;國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物防治與綜合防控崗位科學(xué)家項(xiàng)目（CARS-08-G15）;江蘇特糧特經(jīng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心項(xiàng)目（JATS〔2018〕255）。

作者簡介 張勤雪（1991—），女，河北邯鄲人，博士研究生，研究方向：綠豆遺傳育種。*通訊作者，薛晨晨，副研究員，博士，從事綠豆遺傳育種研究;陳新，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事綠豆遺傳育種研究。

收稿日期 2020-01-17;修回日期 2020-03-16

綠豆（Vigna radiata（L.）Wilczek）是重要的谷類豆類作物和膳食蛋白質(zhì)的良好來源，在東南亞、南美洲和澳大利亞都有廣泛種植[1]。綠豆因?yàn)楹斜绕渌诡惛咚降娜~酸和鐵而受到青睞[2]。世界上對(duì)綠豆植株再生的研究較少，現(xiàn)有的報(bào)道中綠豆的體外再生方法包括從子葉[3]、芽尖[4-5]、嫩葉[6]都能成功地再生成完整植株，目前來說，研究和應(yīng)用比較多的是子葉節(jié)再生體系[7-8]。子葉節(jié)是在多種豆類作物中公認(rèn)的利于再生的外植體，在大豆[9-12]、豇豆[13]和綠豆[8]中都有報(bào)道，但不同的作物間使用子葉節(jié)外植體的體系方法不同。盡管以子葉節(jié)為外植體可能會(huì)存在不定芽的相互抑制，再生困難以及轉(zhuǎn)化時(shí)會(huì)出現(xiàn)嵌合體等問題，但仍然被認(rèn)為是用于豆類作物再生的比較理想的外植體。

植物生長調(diào)節(jié)劑的合理組合搭配使用，這對(duì)于豆類再生率的影響極大，1.1 mg/L 6-BA處理可以使大豆“合豐35”子葉節(jié)再生率達(dá)98%，平均芽數(shù)為3.56個(gè)[12];Sonia等[7]研究發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L 6-BA可以使綠豆PUSA-105子葉節(jié)不定芽分化率高達(dá)100%，平均芽數(shù)為5.3;Bakshi等[13]認(rèn)為1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT可以使豇豆品種Pusa Komal子葉節(jié)再生率達(dá)87%，平均芽數(shù)為6.72。植株再生是大多數(shù)遺傳轉(zhuǎn)化工作的基礎(chǔ)，而豆類作物的再生對(duì)基因型有一定的依賴。綠豆再生體系在國內(nèi)鮮見報(bào)道，為促進(jìn)國內(nèi)綠豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，該試驗(yàn)以綠豆子葉節(jié)為外植體，研究不同的植物激素和不同基因型對(duì)子葉節(jié)愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響，找出最適的基因型和相匹配的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度，為國內(nèi)綠豆的再生體系建立以及后期遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料來自亞蔬中心、中國、泰國和日本的綠豆材料100份。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

萌發(fā)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L 噻苯?。═DZ）+0.5%瓊脂+3%蔗糖。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分以下3種配方，均以B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配方1添加1.0 mg/L芐氨基腺嘌呤（6-BA）、1.0 ?mg/L 激動(dòng)素（KT）和0.1 ?mg/L吲哚丁酸（IBA）;配方2添加1.0 ?mg/L 6-BA和0.1 ?mg/L IBA;配方3添加1.0 ?mg/L 6-BA。不定芽伸長培養(yǎng)基用B5基本培養(yǎng)基加0.1 ?mg/L IBA和0.2 ?mg/L 6-BA。生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基加1.0 ?mg/L IBA。以上所有培養(yǎng)基pH均為5.8。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。光照度3 000～5 000 lx，光/暗周期為16 h/8 h。

1.2.2 外植體制備。滅菌消毒后的種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基光照培養(yǎng)4 d，切除上胚軸和子葉，并在子葉節(jié)處輕輕劃傷，以帶有4～5 mm下胚軸為外植體。

1.2.3 外植體愈傷組織誘導(dǎo)效率計(jì)算。

將子葉節(jié)分別接種于3種不同的培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。每14 d繼代1 次，30 d后統(tǒng)計(jì)外植體表現(xiàn)。愈傷組織誘導(dǎo)率=有愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%。

1.2.4 不同基因型對(duì)子葉節(jié)外植體愈傷組織形成的影響及不定芽分化情況。

將100份不同基因型的子葉節(jié)接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。28 d后統(tǒng)計(jì)不同基因型愈傷組織誘導(dǎo)率，56 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化情況。

1.2.5 不定芽的伸長。將不定芽連同部分愈傷組織分別轉(zhuǎn)接到不定芽伸長培養(yǎng)基上，同時(shí)觀察不同基因型材料的伸長情況。

1.2.6 不定根的誘導(dǎo)。待芽苗伸長至3～4 cm后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，比較不同濃度的激素對(duì)不定根生長誘導(dǎo)的影響;14 d后統(tǒng)計(jì)芽苗的生根率：生根率=形成不定根的苗數(shù)/總轉(zhuǎn)接的苗數(shù)×100%。

1.2.7 煉苗與移栽。待綠豆苗長出5根以上，長度超過2 cm的不定根后，打開瓶蓋，補(bǔ)充少量的滅菌水，放置于恒溫條件下進(jìn)行煉苗，3～4 d后取出綠豆苗并清洗去掉根部的培養(yǎng)基，移栽至裝有蛭石的花盆中，置于溫室進(jìn)行生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組成對(duì)外植體愈傷組織形成的影響

綠豆外植體的愈傷形成能力與培養(yǎng)基內(nèi)添加的激素有很大關(guān)系，該試驗(yàn)隨機(jī)選擇8份綠豆材料（124、137、149、174、175、179、180、184）的外植體，分別接種在3種不同濃度激素的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，第15天開始統(tǒng)計(jì)子葉節(jié)外植體愈傷組織的形成情況。由圖1可見，同一種材料在不同配方上表現(xiàn)的愈傷形成能力不同，綜合8份材料的整體表現(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)在配方1（培養(yǎng)基B5+1.0 ?mg/L 6-BA +1.0 ?mg/L KT+0.1 ?mg/L IBA）上子葉節(jié)外植體愈傷組織形成率最高，該現(xiàn)象在多個(gè)材料中表現(xiàn)一致。因此推斷配方1培養(yǎng)基適合綠豆子葉節(jié)愈傷組織的形成。

2.2 不同基因型對(duì)子葉節(jié)外植體愈傷組織形成的影響

由圖1可見，同一種配方培養(yǎng)基下，不同的基因型材料表現(xiàn)的愈傷形成能力各有不同，證明綠豆子葉節(jié)愈傷的形成與材料的基因型也有很大關(guān)系。

將100份不同基因型的子葉節(jié)接種于配方1培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。將愈傷組織誘導(dǎo)率分為5個(gè)等級(jí)：1級(jí)，愈傷組織誘導(dǎo)率為0;2級(jí)，愈傷組織誘導(dǎo)率為0.01%～30.00%;3級(jí)，愈傷組織誘導(dǎo)率為30.01%～70.00%;4級(jí)愈傷組織誘導(dǎo)率為70.01%～99.00%;5級(jí)愈傷組織誘導(dǎo)率為99.01%～100%。從圖2可以看出，不同基因型子葉節(jié)外植體愈傷組織形成率各不相同，其中愈傷組織誘導(dǎo)率為70%以上的基因型有44個(gè)，這些基因型的子葉節(jié)愈傷組織誘導(dǎo)率較高，比較適宜作為綠豆再生體系建立的材料。

2.3 不同基因型對(duì)子葉節(jié)外植體不定芽形成的影響

將100份基因型的外植體繼續(xù)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），并非形成了愈傷就能形成不定芽，全部材料中有8份材料能很好地形成不定芽，整體生長狀況很好，但這8份材料并非全是愈傷形成率最高的，可見愈傷組織形成率與不定芽生成率并無直接關(guān)系。其中66%材料沒有不定芽生成，可見大部分的綠豆基因型不太容易長不定芽。

2.4 不同基因型對(duì)外植體不定芽生長的影響

選取8份不定芽生長較好的材料，將不定芽連同部分愈傷組織分別轉(zhuǎn)接到不定芽伸長培養(yǎng)基上，觀察8份基因型材料的不定芽伸長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），在芽伸長培養(yǎng)基中，全部的試驗(yàn)材料都有不定芽伸長，因此推測綠豆的不同基因型僅對(duì)子葉節(jié)愈傷組織的形成有影響，對(duì)后期不定芽的伸長影響不大。

2.5 IBA濃度對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響

外植體在不定芽伸長培養(yǎng)基上持續(xù)生長，待芽苗伸長至 3～4 cm后，分別轉(zhuǎn)接到1/2MS+0.1 mg/L IBA、1/2MS+0.5 mg/L IBA和1/2MS+1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基上，比較不同激素濃度對(duì)不定根誘導(dǎo)的影響，14 d 后統(tǒng)計(jì)芽苗的生根率。從表2可以看出，使用濃度為0.1和0.5 ?mg/L 的IBA不促進(jìn)綠豆無菌苗生根，而1.0 mg/L IBA的平均根數(shù)2.35。

2.6 綠豆再生體系優(yōu)化

總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果，初步優(yōu)化了綠豆再生體系。將滅菌后綠豆種子（優(yōu)選192品種）在萌發(fā)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基 +1.0 ?mg/L TDZ+0.5%瓊脂+3%蔗糖）生長4 d（圖4a），切除上胚軸，部分下胚軸和子葉的外植體（圖4b）分別接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（B5+1.0 ?mg/L 6-BA +1.0 ?mg/L KT+0.1 ?mg/L IBA）上生長（圖4c）。每隔14 d進(jìn)行繼代一次，等外植體長出不定芽后，移植到不定芽伸長培養(yǎng)基（B5+0.1 ?mg/L IBA+0.2 ?mg/L 6-BA）進(jìn)行不定芽促伸長過程（圖4d）。待芽苗伸長至 3～4 cm后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基（MS+1.0 ?mg/L IBA）上，待綠豆苗長出5根以上、長度超過2 cm的不定根（圖4e）后，去掉瓶蓋，在培養(yǎng)瓶中加入少量的蒸餾水，放置于培養(yǎng)室進(jìn)行煉苗，3 d后取出綠豆苗并清洗去掉根部的培養(yǎng)基，移栽至裝有蛭石的花盆中，置于溫室進(jìn)行生長（圖4f）。

3 討論與結(jié)論

外植體再生過程中會(huì)受到外植體的取材部位、切割方法以及外植體的年齡等因素影響[14]，不同的材料情況各異;雖然Sonia等[7]認(rèn)為16 h苗齡最佳，但是綠豆的種子16 h后的外植體較小，不利于試驗(yàn)操作和外植體存活。盡管不同苗齡外植體都會(huì)產(chǎn)生叢生芽，但是隨著外植體的年齡增加，芽的頻率和數(shù)量都會(huì)減少。早期研究表明，6 d苗齡的子葉節(jié)外植體再生頻率及不定芽數(shù)量會(huì)降低[15-16]。因此該試驗(yàn)所用的外植體是苗齡為4 d的去除子葉的綠豆子葉節(jié)，該選擇既能便于操作，又盡可能減少對(duì)再生頻率的影響。

植物生長調(diào)節(jié)劑是植物離體再生的重要因素[17]。由于在豆類作物中6-BA被發(fā)現(xiàn)是最有效且廣泛使用的細(xì)胞分裂素，在綠豆外植體誘導(dǎo)不定芽試驗(yàn)中此前已有報(bào)道[3，15]。在一定范圍內(nèi)6-BA 的濃度可與外植體不定芽的數(shù)量成正比，4.0 ?mg/L 6-BA和0.05 ?mg/L IBA的組合可以使大豆不定芽分化率達(dá)到最大值[18]。但激素濃度過大也同時(shí)會(huì)影響不定芽的生長，大豆和綠豆雖然同屬于豆科，但仍有較大差異，其使用濃度有待驗(yàn)證。另外有研究表明，1 mg/L的6-BA條件下，綠豆的子葉節(jié)外植體再生率最高[8];Mendoza等[19]研究表明再生過程中添加1 ?mg/L或2 ?mg/L KT有利于綠豆外植體的再生。因此，該試驗(yàn)借鑒其他豆類的研究結(jié)果，以不同濃度的6-BA、KT和IBA為主要細(xì)胞分裂素（或生長素類物質(zhì)）分別進(jìn)行外植體再生研究，3種不同激素配比的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織形成，結(jié)果表明，在配方1（培養(yǎng)基B5+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L IBA）上不同品種綠豆子葉節(jié)外植體愈傷組織形成率最高（除了175品種顯示持平）;在配方2（培養(yǎng)基B5+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA）和配方3（培養(yǎng)基B5+1.0 mg/L 6-BA）上愈傷組織誘導(dǎo)率變幅在0～80%，相比于配方1，愈傷組織誘導(dǎo)率略低，甚至品種137、149、184的愈傷組織誘導(dǎo)率為0。因此考慮試驗(yàn)結(jié)果的廣適性，以配方1較適合綠豆不定芽誘導(dǎo)。

篩選再生能力較強(qiáng)的基因型是高頻率誘導(dǎo)綠豆再生植株的關(guān)鍵，也是綠豆高效再生體系建立的前提。Sonia等[7]研究表明不同基因型綠豆子葉節(jié)的不定芽率在45%～100%，Bakshi等[13]研究表明不同基因型綠豆子葉節(jié)的不定芽率在16%～87%。但國內(nèi)外綠豆資源不全相同，大部分國外試驗(yàn)材料不適宜國內(nèi)研究和應(yīng)用，篩選出適合國內(nèi)研究應(yīng)用的綠豆材料，對(duì)國內(nèi)綠豆研究意義重大。該試驗(yàn)對(duì)綠豆100個(gè)基因型的再生能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型之間的愈傷組織誘導(dǎo)率有很大差異，愈傷組織誘導(dǎo)率在0～100%，其中愈傷組織誘導(dǎo)率為30.01%～70.00%的基因型最多。繼續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)66%的品種再生能力較低，子葉節(jié)外植體所產(chǎn)生的愈傷組織全部褐化，無不定芽產(chǎn)生，因此并非能長出愈傷就能很好地開展再生，或者該類型基因型需要特殊的激素條件進(jìn)行生長。8份材料不定芽再生能力最強(qiáng)，雖然愈傷形成率并非都最高，但都能很好地形成不定芽，其后完成不定芽伸長和生根的過程，證明綠豆的再生體系最關(guān)鍵的一步仍然是不定芽誘導(dǎo)。該試驗(yàn)以8份材料為試驗(yàn)對(duì)象，優(yōu)化了綠豆的再生體系，為綠豆的無性繁殖技術(shù)以及遺傳轉(zhuǎn)化體系建立奠定了一定的基礎(chǔ)。

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