UPLC-QTOF高分辨質(zhì)譜法定性檢測(cè)雞蛋中的斑蝥黃

房艷 *，高俊海 ，于思雨

1. 譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司（北京 100095）；2. 譜尼測(cè)試集團(tuán)北京科學(xué)技術(shù)研究院有限公司（北京 100095）

雞蛋因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而備受大眾青睞，市售雞蛋一般分為自然放養(yǎng)或較大范圍圈養(yǎng)的雞產(chǎn)蛋（土雞蛋）和人工飼料籠養(yǎng)的雞產(chǎn)蛋（洋雞蛋），此外也不乏有機(jī)雞蛋、富硒雞蛋等概念蛋。相關(guān)研究資料表明，土雞蛋在蛋黃比例、類(lèi)胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、膽固醇等指標(biāo)與洋雞蛋具有明顯差異，且大多數(shù)往往在表征上體現(xiàn)為蛋黃顏色更深[1-3]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，人們對(duì)雞蛋品質(zhì)的要求也越來(lái)越高。在利益的驅(qū)使下，不法商販通過(guò)在飼料中超量添加斑蝥黃等著色劑，人為加深雞蛋蛋黃色澤，以增加感官效果及經(jīng)濟(jì)效益。

斑蝥黃（Canthaxanthin，C40H52O2）又稱(chēng)角黃素，屬于類(lèi)胡蘿卜素，是加麗素紅的有效成分[4-5]，呈橙紅色，可通過(guò)家禽消化道吸收并最終富集于蛋黃[6-7]，是一種較為常用的飼料添加劑。然而，相關(guān)研究結(jié)果表明斑蝥黃被人體吸收后可能會(huì)在視網(wǎng)膜蓄積造成視力減退等[8]，且具有一定的肝損傷性。因此，歐盟規(guī)定飼料中斑蝥黃的添加量不得高于25 mg/kg[9]，日本于2006年實(shí)施的肯定列表制度中也規(guī)定禽蛋等動(dòng)物源性食品中角黃素最大殘留量為100 μg/kg[10]。

目前，雞蛋中斑蝥黃的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[11-15]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法[16-18]等。此次試驗(yàn)擬利用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF）技術(shù)建立一種分辨率更高的斑蝥黃定性檢測(cè)方法，對(duì)生雞蛋和熟雞蛋進(jìn)行同步分析，并與標(biāo)準(zhǔn)方法SN/T 2327—2009《進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中角黃素、蝦青素的檢測(cè)方法》中UPLC-MS/MS部分的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 儀器、設(shè)備與試劑

Waters Xevo G2-XS QTOF/UPLC系統(tǒng)（配備二極管陣列檢測(cè)器PDA，美國(guó)Waters公司）；LC-20AD高效液相色譜儀-LCMS-8045質(zhì)譜儀（日本島津公司）；T18均質(zhì)機(jī)（德國(guó)IKA公司）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific IN.D.ustries公司）；CT15RT高速冷凍離心分離機(jī)（中國(guó)上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；Millipore-Q超純水凈化儀（美國(guó)Millipore-Q公司）；AB135-S分析天平（感量0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司）；DZKW-4恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH-500E超聲清洗器（中國(guó)昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；濾膜（尼龍，0.22 μm，美國(guó)Agela Technologies公司）。

斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度95%，CAS 517-78-3，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；正己烷（色譜級(jí)，純度≥95%，CAS 110-54-3，Hipure chem公司）；正丙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，純度99.8%，美國(guó)Thermo Fisher公司）；乙酸銨（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；甲酸（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；亮氨酸腦啡肽（分析純，美國(guó)Waters公司）；乙腈（質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)Honeywell Inernational公司）；UPLC-QTOF流動(dòng)相用水（質(zhì)譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司）；除UPLC-QTOF流動(dòng)相用途之外的水皆為超純水，經(jīng)Millipore-Q超純水凈化儀制備；乙腈提取劑（0.25 g BHT溶解于500 mL乙腈）；BHT-乙腈溶液（0.5 g BHT溶解于500 mL乙腈）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取蛋黃并記錄蛋黃顏色（羅氏比色扇法），混勻。其中，取部分為生雞蛋試樣；取部分煮熟后用均質(zhì)機(jī)充分搗碎、混勻，為熟雞蛋試樣。

1.2.2 樣品前處理

稱(chēng)取約1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈提取劑及10 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混勻，在35 ℃以下水浴超聲提取10 min，以3 000 r/min離心5 min。將上清液移入預(yù)置有20 mL正己烷的分液漏斗中，振搖后靜置分層；收集下層乙腈相，正己烷相在分液漏斗，待試樣后續(xù)脫脂重復(fù)使用。按上述步驟對(duì)離心管中的殘留物用10 mL乙腈提取劑重復(fù)提取，所得提取液用上述正己烷相脫脂。合并2次脫脂后所收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，在40 ℃以下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，用乙腈溶解并定容至5.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液待測(cè)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用BHT-乙腈溶液溶解并稀釋?zhuān)苽涑少|(zhì)量濃度在0.1～200 ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)工作液，供UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS分析。以定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，保留時(shí)間和碎片離子定性，外標(biāo)法定量。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 UPLC-QTOF條件

色譜柱，Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣體積，2 μL；流速，0.3 mL/min；柱溫，30 ℃；流動(dòng)相，乙腈（A）和含0.2%甲酸的5 mmol/L的乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫，0～3.4 min，90%～98%（A）；3.4～3.8 min，98%～90%（A）；3.8～5.0 min，90%（A）。

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，MS/MS模式；離子源溫度，115 ℃；脫溶劑氣溫度，340 ℃，氮?dú)?；脫溶劑氣流速?50 L/h；錐孔氣流速，45 L/h，氬氣；毛細(xì)管電壓，3.0 kV；錐孔電壓，20 V；碰撞能30 V；四極桿低質(zhì)量數(shù)分辨率，15；實(shí)時(shí)校正液，亮氨酸腦啡肽（正離子條件m/z 556.277 1）。

1.2.4.2 UPLC-MS/MS條件

色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣體積，2 μL；流速，0.4 mL/min；柱溫，40 ℃；流動(dòng)相，乙腈-0.1%甲酸溶液（92︰8，V/V），等度洗脫5 min。

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度，300 ℃；霧化氣、加熱氣、干燥氣，氮?dú)?；碰撞氣，氬氣；霧化氣流量，180 L/h；加熱氣流量，600 L/h；干燥氣流量，600 L/h；DL溫度，250 ℃；加熱模塊溫度，400 ℃；毛細(xì)管電壓，3.0 kV；檢測(cè)器電壓，1.74 kV；監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 斑蝥黃的MRM參數(shù)

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 QTOF結(jié)果分析

QTOF具有極高的分辨率[（FWHM）＞40 000]，可檢測(cè)組分并收集精確質(zhì)量數(shù)母離子和碎片離子。相比于UPLC-MS/MS精確化合物質(zhì)荷比至小數(shù)點(diǎn)后2位，QTOF可至小數(shù)點(diǎn)后4位且質(zhì)量精度仍＜10-6，具有極高的可靠性和穩(wěn)定性。QTOF分析結(jié)果表明，在正離子模式下，斑蝥黃的一級(jí)質(zhì)譜以準(zhǔn)分子離子峰m/z 565.404 5[M+H]為基峰，主要碎片離子為m/z 133.067 6和m/z 203.146 0，且上述兩碎片離子的產(chǎn)生方式如圖1所示。同時(shí)，其它碎片離子還包括m/z 185.135 5，157.103 0，119.083 3和215.144 9等，且全部碎片情況均與將斑蝥黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入MassLynx并按偏差3 mDa和最可能斷鍵方式等條件篩選后輸出的結(jié)果相對(duì)一致，具體信息見(jiàn)表2。

圖1 斑蝥黃QTOF質(zhì)譜圖

表2 斑蝥黃碎片信息表

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及譜圖

斑蝥黃在UPLC-QTOF條件下峰形良好，保留時(shí)間為2.69 min，見(jiàn)圖2。在0.1～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程為Y=6 244.3X-4 779.3，R2=0.999 4，見(jiàn)圖3。

圖2 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液UPLC-QTOF譜圖（100 ng/mL，RT 2.69 min）

圖3 QTOF條件下斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樣品測(cè)定

樣品預(yù)處理及UPLC-MS/MS條件參考SN/T 2327—2009。選取4種蛋黃顏色不同的雞蛋樣品，利用UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS對(duì)生雞蛋（F）和熟雞蛋（C）試樣進(jìn)行同步分析，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表3。

試驗(yàn)結(jié)果表明，所有樣液的譜圖中均具有分離度較高且保留時(shí)間與斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)偏差在±5%以內(nèi)的目標(biāo)峰，且目標(biāo)峰的碎片離子精確質(zhì)荷比及其豐度與斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本一致，定性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法[14]完全相同，說(shuō)明該方法適用于定性檢測(cè)雞蛋中的斑蝥黃，且該方法的測(cè)定低限也與標(biāo)準(zhǔn)方法[14]（0.1 mg/kg）相同。同時(shí)，在定量方面，除斑蝥黃含量低于0.01 mg/kg的試樣外，UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS分析試樣時(shí)的相對(duì)偏差在2.7%～5.5%之間；當(dāng)斑蝥黃含量低于0.01 mg/kg時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品溶液質(zhì)量濃度接近0.1 ng/mL最低定量濃度，相對(duì)偏差在1.4%～19.4%之間；但兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均相對(duì)一致，且均能相對(duì)準(zhǔn)確地反映雞蛋中斑蝥黃的含量水平，在一定程度上說(shuō)明該方法可以作為雞蛋中斑蝥黃質(zhì)量控制的有效輔助手段。

表3 UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS的測(cè)試結(jié)果

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF）技術(shù)，建立了一種斑蝥黃的定性檢測(cè)方法。該方法具有較高的靈敏度，與標(biāo)準(zhǔn)方法相當(dāng)。相比于UPLC-MS/MS，QTOF可實(shí)現(xiàn)精確化合物質(zhì)荷比至小數(shù)點(diǎn)后4位且質(zhì)量精度仍小于10-6，具有極高的可靠性和穩(wěn)定性，并可以同時(shí)識(shí)別更多碎片離子，便于更準(zhǔn)確的定性研究。此次試驗(yàn)為雞蛋中斑蝥黃的檢測(cè)提供了一種高分辨率的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于蛋品的市場(chǎng)監(jiān)管具有重要意義。