胎菊中綠原酸的提純與結(jié)構(gòu)鑒定

戴富才，趙麗艷，曹祥銘，肖立偉，景學(xué)敏

廊坊師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院（廊坊 065000）

胎菊（Foetus chrysɑnthemum）是杭白菊的一種，是尚未完全開放的杭白菊[1]。胎菊能散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒。胎菊中含有多種有效成分，如揮發(fā)油、黃酮類物質(zhì)、綠原酸、多糖類、3, 5-O-雙咖啡酰基奎寧酸等 。綠原酸是胎菊中一種重要成分，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降糖、增加白細(xì)胞數(shù)量等多種生理作用[2]。

綠原酸（Chlorogenic acid）是一種有機(jī)酸，分子式為C16H18O9，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等極性溶劑，在乙酸乙酯中微溶，在氯仿、石油醚、苯等親脂性溶劑中難溶[3]。近幾年，綠原酸在人們的生活中被廣泛使用，我們平時用的綠原酸主要有兩個來源：一是人工合成，這種方法目前還不太成熟，應(yīng)用較少；二是從天然產(chǎn)物中提取，主要集中在金銀花[4-6]、杜仲[7-8]等天然產(chǎn)物上。市場上綠原酸供應(yīng)不足，導(dǎo)致綠原酸價(jià)格居高不下。所以擴(kuò)大綠原酸的提取來源并研究其提純工藝就十分有必要了。胎菊中綠原酸的含量較高，可以作為提取綠原酸的原料，而從胎菊中提取綠原酸的研究不多[9]。因此，如何從胎菊中分離出高純度的綠原酸產(chǎn)品，成為研究的焦點(diǎn)。

研究采用超聲波粗提-大孔樹脂純化-萃取分相-聚酰胺柱層析分離-產(chǎn)品結(jié)晶的方法，從胎菊中得到純度較高的綠原酸產(chǎn)品。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品，對胎菊綠原酸產(chǎn)品進(jìn)行表征，并計(jì)算產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度，為胎菊中綠原酸的應(yīng)用提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料與試劑

胎菊（產(chǎn)地浙江），云南楷林中藥飲片有限責(zé)任公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%），武漢天植生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（優(yōu)級純），天津渤化化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（光譜純），上海麥克林生化有限公司；DMSO-d6（含量為99.9%），上海麥克林生化有限公司；NKA-9大孔樹脂、聚酰胺粉、濃鹽酸、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、氫氧化鈉，分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Agilent 1260型高效液相色譜儀，Agilent科技有限公司；Ascend? 400高場核磁共振波譜儀，德國BRUKER公司；DZF-6050MBE真空干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ-250B超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；XFB-400高速中藥粉碎機(jī)，湖南吉首市中湘制藥機(jī)械廠；TD4低速臺式離心機(jī)，湖南儀器儀表總廠；酒精計(jì)，河北省武強(qiáng)紅星玻璃儀表廠；離子交換柱（直徑32 mm，長300 mm），天津市天玻玻璃儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 胎菊粗提液的制備

取胎菊粉碎，過20目篩，待用。

將30.0 g的樣品放入500 mL的錐形瓶中，并參考文獻(xiàn)[10]條件對胎菊中綠原酸進(jìn)行粗提取，即60%的乙醇溶解，pH為2，料液比為1∶14（g/mL），在80 W，50℃超聲提取50 min。重復(fù)上述步驟提取濾渣，合并2次濾液。將濾液濃縮至無醇味（用酒精計(jì)測量的乙醇體積分?jǐn)?shù)約為2%），在4 ℃放置24 h，離心（3 000 r/min，離心10 min），上清液即為胎菊粗提液。

1.3.2 大孔樹脂對胎菊綠原酸的初步分離

1.3.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

參照文獻(xiàn)[10]預(yù)處理NKA-9大孔樹脂，活化備用。

1.3.2.2 大孔樹脂初步分離胎菊中的綠原酸[11]

將處理好的NKA-9大孔樹脂，用濕法裝柱，將其裝入離子交換柱粗柱，柱高15 cm左右，將胎菊粗提液在大孔樹脂中進(jìn)行過柱，上樣液濃度為0.022 mg/mL，吸附pH 3，上樣液體積為12 BV，控制吸附流速3 BV/h，以4 BV的30%乙醇溶液為解吸液，控制解吸流速3 BV/h左右。用錐形瓶收取分離液，減壓濃縮至無醇味（酒精計(jì)測得乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%）待用。

1.3.3 乙酸乙酯萃取、石油醚分相進(jìn)一步分離胎菊中的綠原酸

將大孔樹脂純化后的粗品溶液用水調(diào)節(jié)pH在2左右，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加乙酸乙酯進(jìn)行萃取，粗品溶液與萃取劑的體積比為1∶2，萃取2次后，將乙酸乙酯相合并。乙酸乙酯相加分相劑石油醚，體積比為4∶1，收集水相[12]。

1.3.4 聚酰胺樹脂純化胎菊中綠原酸

1.3.4.1 聚酰胺樹脂的預(yù)處理

參照文獻(xiàn)[10, 13]預(yù)處理聚酰胺樹脂，活化備用。

1.3.4.2 聚酰胺進(jìn)一步純化綠原酸

使用濕法裝柱的方式，將聚酰胺樹脂進(jìn)行裝柱，控制柱高15 cm，將經(jīng)1.3.3萃取分相后的水相樣品溶液濃縮（濃度盡量大，以不析出晶體為準(zhǔn)），加于聚酰胺柱頂，控制上樣量在0.5 BV左右，先用pH為3的鹽酸水溶液2 BV沖洗除雜，然后分別用10%乙醇2 BV、30%乙醇4 BV作為解吸液梯度洗脫，收集30%乙醇4 BV解吸液，備用。

1.3.5 乙酸乙酯重結(jié)晶精制胎菊中的綠原酸

純化聚酰胺樹脂后，將30%的解吸液減壓濃縮，直到出現(xiàn)大量晶體。冷藏24 h后，將晶體減壓過濾，并用乙酸乙酯重結(jié)晶[10,14]，即可得胎菊綠原酸產(chǎn)品。1.3.6 胎菊中的綠原酸的高效液相色譜分析

1.3.6.1 色譜條件

色譜柱為SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，色譜純乙腈-0.1%磷酸水溶液（各體積隨時間變化見表1）；流速，1.0 mL/min，柱溫，25 ℃；檢測波長，327 nm；進(jìn)樣量，10 μL[10]。

表1 乙腈與0.1%磷酸水溶液的體積比隨時間變化表

1.3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

參照文獻(xiàn)[10]，在棕色容量瓶中，用50%色譜純甲醇，配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。4 ℃左右冰箱保存，待用。

1.3.6.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[15]，取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。用高效液相色譜法在327 nm處測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到一元線性回歸方程：y=35 993.84x-11.916，相關(guān)系數(shù)R=0.998 8。表明綠原酸的濃度在0.01～0.06 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

1.3.6.4 供試品溶液

參照文獻(xiàn)[10]，在棕色容量瓶中，用50%色譜純甲醇，配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的綠原酸產(chǎn)品溶液。4 ℃左右保存，待用。

1.3.7 胎菊中綠原酸的紫外-可見光譜分析

取少量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、胎菊綠原酸產(chǎn)品，用50%色譜純甲醇溶解，進(jìn)行紫外可見光譜表征。

1.3.8 胎菊中綠原酸的紅外光譜分析

取少量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、胎菊綠原酸產(chǎn)品，用干燥的溴化鉀分別進(jìn)行壓片，進(jìn)行紅外光譜表征。

1.3.9 胎菊中綠原酸的核磁共振氫譜分析

取適量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、胎菊綠原酸產(chǎn)品，以DMSO-d6為溶劑，進(jìn)行核磁共振氫譜表征。

1.3.10 胎菊綠原酸產(chǎn)品產(chǎn)率的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取200.000 g胎菊，按照最佳工藝純化，所得產(chǎn)品充分干燥，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，代入式（1），計(jì)算產(chǎn)率[16]。

式中：Y為胎菊綠原酸的產(chǎn)率，%，m為胎菊綠原酸產(chǎn)品質(zhì)量，g；G為所用胎菊干粉質(zhì)量，g。

1.3.11 胎菊綠原酸產(chǎn)品純度的計(jì)算

按照1.3.6小節(jié)，將0.2 mg/mL的胎菊綠原酸產(chǎn)品和0.2 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品在相同的液相色譜條件下，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄綠原酸峰面積，代入式（2）計(jì)算產(chǎn)品純度。

式中：P為胎菊綠原酸產(chǎn)品的純度，%；A為胎菊綠原酸產(chǎn)品的液相色譜峰面積，mAU·s；As為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜峰面積，mAU·s。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜分析

圖1 液相色譜圖

由圖1a可知，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時間為6.076 min，與胎菊粗提液（圖1b）綠原酸位置為6.074 min大致相等，因此可以確定胎菊提取液中含有綠原酸，但是雜質(zhì)峰較多。經(jīng)NKA-9大孔樹脂提純（圖1c），溶液變?yōu)槌吻?，除去了大部分雜質(zhì)峰。乙酸乙酯萃取石油醚分相后（圖1d），綠原酸純度進(jìn)一步提高，左側(cè)雜質(zhì)峰消失，這是因?yàn)橐宜嵋阴ポ腿〕龃蟛糠謽O性大于綠原酸的雜質(zhì)；而石油醚分相過程又除掉極性小于綠原酸的雜質(zhì)[12]。聚酰胺純化后（圖1e），綠原酸附近的雜質(zhì)峰明顯減少，因?yàn)橛胮H為3的酸水沖洗時，綠原酸電離被抑制，大部分吸附在聚酰胺樹脂上，而大部分雜質(zhì)則被沖洗下去，梯度解吸能最大程度地純化胎菊中綠原酸。乙酸乙酯重結(jié)晶后（圖1f），幾乎看不到雜質(zhì)峰，綠原酸產(chǎn)品的純度很高。

2.2 紫外-可見光譜表征

由圖2可以看出，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖2a）和綠原酸產(chǎn)品（圖2b）的出峰位置幾乎相同，在327 nm左右有最大吸收峰，與文獻(xiàn)[17]的結(jié)果相同，進(jìn)一步表明產(chǎn)品為綠原酸。

圖2 紫外-可見光譜圖

2.3 紅外光譜表征

由綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖3a）和胎菊綠原酸產(chǎn)品（圖3b）的紅外光譜圖可知，綠原酸產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰位置大致相同，綠原酸產(chǎn)品的主要吸收峰列于表2。由光譜分析可知，測定結(jié)果與圖4綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式一致，以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證該產(chǎn)品為綠原酸[18-20]。

圖3 紅外光譜圖

表2 胎菊中綠原酸產(chǎn)品的紅外光譜分析

圖4 綠原酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式[10, 21]

2.4 核磁共振氫譜表征

由圖5b可知，胎菊綠原酸產(chǎn)品的化學(xué)位移及對應(yīng)圖4中氫的位置分別為：δH 7.42（1H，d，J=16.0 Hz，H-7′），δH 7.04（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），δH 6.99（1H，dd，J=8.2 Hz，2.0 Hz，H-6′），δH 6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），δH 6.15（1H，d，J=16.0 Hz，H-8′），δH 5.04-5.09（1H，m，H-3），δH 3.92（1H，brs，H-5），δH 3.56（1H，brs，H-4），δH 1.75-2.05（4H，m，H-2，H-6）。結(jié)果表明：胎菊綠原酸產(chǎn)品和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)位移幾乎一致，以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)品為綠原酸[10,21]。

圖5 核磁共振氫譜

2.5 胎菊中綠原酸的產(chǎn)率

試驗(yàn)所用胎菊干粉質(zhì)量為200.000 g，純化后胎菊綠原酸產(chǎn)品質(zhì)量為36 mg，將數(shù)據(jù)代入式（1），計(jì)算得產(chǎn)率為0.018%。

2.6 胎菊中綠原酸的純度

在相同的液相色譜條件下，胎菊綠原酸產(chǎn)品（圖1f）的液相色譜峰面積為7 761.58 mAU·s，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖1a）的液相色譜峰面積為7 860.63 mAU·s，將數(shù)據(jù)代入式（2），計(jì)算得胎菊綠原酸產(chǎn)品的純度為98.7%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

研究將胎菊中綠原酸進(jìn)行提取、純化，建立了一套高效的純化工藝：將胎菊粉碎，超聲提取得粗提液，經(jīng)大孔樹脂初步提純，乙酸乙酯萃取、石油醚分相，聚酰胺柱色譜分離，乙酸乙酯重結(jié)晶得產(chǎn)品；經(jīng)過高效液相色譜、紫外-可見光譜、傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜技術(shù)分析得產(chǎn)品為綠原酸，產(chǎn)率為0.018%，經(jīng)液相色譜定量計(jì)算，其純度可達(dá)98.7%。

3.2 討論

用聚酰胺純化胎菊中綠原酸，梯度洗脫時，最初用pH為3的酸水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇各2 BV解吸。用pH為3的酸水沖洗時，綠原酸電離被抑制，大部分綠原酸吸附在聚酰胺樹脂上，而色素等水溶性雜質(zhì)則被沖洗下去；10%乙醇解吸時，液相色譜顯示仍有少量水溶性雜質(zhì)，40%乙醇洗脫時，則有較多極性小于綠原酸的雜質(zhì)，而20%乙醇和30%乙醇洗脫時，經(jīng)液相色譜峰面積計(jì)算，純度都在95%以上。因此，為保證產(chǎn)品純度，并簡化純化步驟，10%乙醇解吸后，直接用4 BV 30%乙醇解吸，收集此段解吸液，進(jìn)行進(jìn)一步重結(jié)晶純化處理。