提高愈創(chuàng)木酚染色法檢測稻谷新陳度準(zhǔn)確性的研究

王天嬌，龐文淥*

（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，沈陽 110034）

稻谷收購過程中，如能快速、準(zhǔn)確地判斷出稻谷的新陳度，對于有效控制稻谷收購中“以次充好、以陳充新”的違法行為、減少售買雙方因新陳度認(rèn)定而產(chǎn)生的糾紛無疑會起到重要的作用。在稻谷新陳度檢測實踐中發(fā)現(xiàn)，采用GB 5492-2008附A中愈創(chuàng)木酚染色法檢測稻谷新陳度，具有原理簡單、操作方便、檢測快速等突出優(yōu)點，但也存在重現(xiàn)性差、結(jié)果不準(zhǔn)等缺陷。一是檢測結(jié)果隨樣品狀態(tài)變化而變化，如同一份樣品使用糙米與大米的檢測結(jié)果就不同；二是檢測結(jié)果隨檢測試驗操作條件變化而變化，如檢測時的溫度不同、試劑的用量不同、反應(yīng)的時間不同則檢測結(jié)果也不同。這些問題的存在不僅影響了該法的推廣使用，也容易因前后檢驗結(jié)果不一致而引起糾紛。

因此，有必要通過實驗篩選出最佳檢測條件，進(jìn)而提高愈創(chuàng)木酚染色法檢測稻谷新陳度的準(zhǔn)確性。

1 實驗原理與設(shè)計

1.1 實驗原理

新鮮稻谷米粒皮層中所含的過氧化物酶 （一種以血紅素為輔基的酶），是一種能夠催化過氧化物分解的酶。在過氧化物酶的作用下H2O2分解釋放出O2，使愈創(chuàng)木酚被氧化生成紅色的四愈創(chuàng)琨，進(jìn)而使被愈創(chuàng)木酚溶液浸過的米粒也被染成紅色。由于新稻谷所含的過氧化物酶活性強故被染成紅色 （稻谷越新鮮，過氧化物酶活性就越高，染色就越深），而陳稻谷由于該酶已失活故不變色，因此可依據(jù)樣品中變色米粒占供試樣品粒的百分率判斷稻谷新陳度。

1.2 實驗設(shè)計

針對檢測結(jié)果隨檢測實驗操作條件 （如試劑的濃度不同、檢測時的溫度不同、反應(yīng)的時間不同）不同而出現(xiàn)波動的問題，擬采用對照實驗篩選出最佳檢測條件組合。按照三因子（雙氧水濃度、染色溫度、染色時間）、三水平 （雙氧水濃度分別為1%、2%、3%，染色溫度分別為20℃、30℃、40℃，染色時間分別為 1 min、2 min、3 min）設(shè)計正交實驗，正交實驗因素水平如表1所示，共匹配出的9種實驗條件組合，按照GB 5492-2008附表A中愈創(chuàng)木酚反應(yīng)法進(jìn)行實驗操作，進(jìn)而得出每一實驗條件組合下的變色粒數(shù)，據(jù)此計算其新陳度?；谏鲜龅膶嶒炘恚惣Z粒無論反應(yīng)條件如何都不會變色，所以能變色的肯定是新糧粒），在9組實驗結(jié)果中，新稻谷染色率最高的（新陳度最高的）那組應(yīng)該更接近實際的新陳度檢驗條件，故該組實驗條件組合即為最佳檢測條件。

表1 正交實驗因素、水平表

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 儀器用具

吉林鼎力糧食機械有限公司產(chǎn)JLGJ-45型電動礱谷機，鄭州檢驗?zāi)朊讬C廠產(chǎn)JNMJ-3型碾米機，上海力辰幫西儀器科技有限公司產(chǎn)HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，100 mL容量瓶，100 mL量筒，5 mL移液管，18 mm×180 mm具塞試管，培養(yǎng)皿等。

2.1.2 試劑試液

1%愈創(chuàng)木酚溶液：移取1 mL愈創(chuàng)木酚原液到100 mL容量瓶中，先加入60 mL無水乙醇使之溶解，再加入蒸餾水稀釋定容至100 mL。愈創(chuàng)木酚溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，以防氧化失效。

1%過氧化氫溶液：移取1 mL的30%過氧化氫原液置于100 mL容量瓶中，加入29 mL蒸餾水混合均勻至30 mL。

2%過氧化氫溶液：移取2 mL的30%過氧化氫原液置于100 mL容量瓶中，加入28 mL蒸餾水混合均勻至30 mL。

3%過氧化氫溶液：移取3 mL的30%過氧化氫原液置于100 mL容量瓶中，加入27 mL蒸餾水混合均勻至30 mL。

2.1.3 實驗樣品

遼寧沈陽地區(qū)2019年產(chǎn)東北晚粳稻谷（即當(dāng)年秋季新收獲的稻谷）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品處理

將樣品稻谷先用礱谷機脫掉外殼，然后用碾米機碾磨至相當(dāng)于四級大米精度（背溝有皮，米粒表面皮層殘留面積不超過1/3的米粒占75%以上），使其暴露出新鮮的皮層及胚部。

2.2.2 染色反應(yīng)

以樣品處理獲得的大米為實驗材料，自制27份實驗樣品，每份隨機數(shù)取大米50粒。分為9個實驗組，為了提高實驗結(jié)果的可信度，每組使用三份樣品做平行實驗，分別在正交實驗設(shè)計的9組實驗條件下進(jìn)行染色反應(yīng)。操作順序為：將每組試樣分別裝入18 mm×180 mm具塞玻璃試管并加入1%愈創(chuàng)木酚溶液浸過大米，搖動震蕩30次后棄去液體，再加入3滴不同濃度的（1%、2%、3%）過氧化氫溶液并放在不同溫度（20℃、30℃、40℃）的水浴中反應(yīng)不同的時間（1 min、2 min、3 min），然后將試樣轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中棄去液體，挑選并統(tǒng)計粒面呈紅色的米粒計算染色率。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 實驗結(jié)果

以過氧化氫濃度（%）、反應(yīng)時間（min）、反應(yīng)溫度（℃）為影響因素，采取正交實驗的方法分別測得不同實驗條件組合下的米粒染色結(jié)果如表2所示。

3.2 結(jié)果分析

從表2中數(shù)據(jù)可見，當(dāng)加入過氧化氫的濃度不同、反應(yīng)溫度不同、反應(yīng)時間不同時，檢測結(jié)果也不盡相同；過氧化氫濃度越高、反應(yīng)溫度越高、反應(yīng)時間越長，染色率越高；從影響因素的主次看，過氧化氫濃度＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時間；最佳檢測條件組合為過氧化氫濃度3%、反應(yīng)溫度40℃、染色時間3 min（因該條件下染色率最高為92%）。

表2 正交實驗結(jié)果表

4 實驗結(jié)論與建議

4.1 實驗結(jié)論

愈創(chuàng)木酚染色法檢測稻谷新陳度具有快速、簡便的優(yōu)點，但實驗結(jié)果受實驗條件影響較大，不宜準(zhǔn)確判定；愈創(chuàng)木酚染色法檢測稻谷新陳度，即使是未摻一粒陳稻的新稻谷也不會全部被染色，最高染色率也只在九成上下。

4.2 實驗建議

4.2.1 規(guī)范檢測條件，減小檢測誤差

前述實驗條件不同檢測結(jié)果不同。因此，為了減小檢測誤差、避免出現(xiàn)糾紛，建議規(guī)范愈創(chuàng)木酚染色法檢測稻谷新陳度的實驗條件，如過氧化氫的濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等。盡管在過氧化氫濃度為3%、反應(yīng)溫度為40℃、反應(yīng)時間為3 min時染色率最高，但考慮到新陳度檢測需要方便、快捷，建議用濃度3%的過氧化氫做試劑，反應(yīng)在20℃以上的室內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)時間1 min以上（不急可等到3 min）。另外，如果為了提高檢測結(jié)果的可信度做雙實驗時，在兩次結(jié)果相差不大的情況下，應(yīng)以染色率最高的為檢測結(jié)果。其理由是：基于前面所述的檢測原理，能夠被染色的肯定是新稻谷，但由于受反應(yīng)條件的限制并不是所有的新稻谷都能被染色，因而以染色率最高的代表被測樣品的新陳度應(yīng)該更符合被測稻谷真實情況。

4.2.2 染色率接近九成，可判定為未摻陳的新稻谷

為了避免因樣品不真對實驗造成的影響，本實驗所用稻谷均采自當(dāng)年收獲的新稻谷。從實驗結(jié)果可以看出，即使是未混入一粒陳稻的新稻谷也不會100%被染色。究其原因，①樣品中有些稻?？赡苁茏陨硪蛩鼗虿∠x害影響已經(jīng)喪失生理活性，其皮層中的過氧化酶已經(jīng)失活，所以即使是新稻粒也不會被染色；②樣品中有些生理活性稍差的稻粒，在過氧化氫濃度及反應(yīng)溫度不夠高、反應(yīng)時間不夠長的情況下，也可能不會染色或染色不明顯。據(jù)此，在使用此法檢測稻谷新陳度時，即使樣品未完全變色也不能認(rèn)定摻入陳稻，只要染色率接近90%（在4.1建議的實驗條件下）基本上可認(rèn)定為無摻陳的當(dāng)年收獲新稻谷。