應用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜建立茶葉中農(nóng)藥殘留的篩查與確證方法

喬勇升, 王俊虎, 仇雅靜, 錢忠義, 胡 慧, 陳 偉, 王 萍

(泰州市食品藥品檢驗所, 江蘇 泰州 225300)

茶是世界上廣受歡迎的消費飲料。由于茶多酚、咖啡因和氨基酸等許多功能性成分的存在,茶對人類健康具有廣泛的益處[1,2]。但是,茶樹在種植和生長中不可避免地要使用農(nóng)藥來保護自身免受雜草、真菌或昆蟲的侵害[3],這些農(nóng)藥化合物的殘留可以通過食物鏈進行積累和放大,如果超過一定水平,將會增加對人類健康造成損害的風險[4]。各國政府和國際機構(gòu)對合法授權(quán)的各種農(nóng)藥化合物的最大殘留限量(MRLs)制定了嚴格的法規(guī)[5]。這些法規(guī)被視為貿(mào)易標準,以確保進出口食品、食用農(nóng)產(chǎn)品的消費安全,降低對健康造成危害的風險。但是法規(guī)規(guī)定的有害化合物數(shù)量有限,評估各類農(nóng)藥在食品的生產(chǎn)、加工及流通等環(huán)節(jié)的暴露風險迫在眉睫。因此,在最短的時間內(nèi),以合理的成本通過一次分析獲得樣品中盡可能多的農(nóng)藥殘留信息,對于檢驗實驗室來說變得越來越重要。

大多數(shù)用于監(jiān)控農(nóng)藥殘留的分析方法依賴于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[6-8]。由于極性、非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定等因素[9],液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),特別是聯(lián)用三重四極桿質(zhì)譜儀被認為是分析各種基質(zhì)中農(nóng)藥殘留最廣泛應用的技術(shù)。但是這些方法在一次運行中監(jiān)控的化合物數(shù)量有限,并且為了準確定性和定量,必須獲得大量的參考標準物質(zhì),預設置質(zhì)譜采集參數(shù)。同時意味著它不能檢測樣品中存在但前期未設置采集參數(shù)的化學污染物。因此,針對有毒害的化學污染物質(zhì)大規(guī)模的定向或非定向篩查,迫切需要引入新技術(shù)。

高分辨率質(zhì)譜(HRMS)憑借質(zhì)量范圍廣、分辨率和質(zhì)量精度高、分析速度快等特點,現(xiàn)已成為檢驗檢測擴大分析范圍和降低錯誤率的首選。其主要優(yōu)點之一是能夠以全掃描模式記錄無限數(shù)量的化合物,使回顧性分析成為可能。并且由于高分辨率、高靈敏性等數(shù)據(jù)采集特性,HRMS可以對沒有參考標準的化合物進行定性篩查分析。質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)獲取方式包括信息依賴型數(shù)據(jù)采集模式(data dependent acquisition, DDA)與非信息依賴型數(shù)據(jù)采集模式(data independent acquisition, DIA),其中DIA模式是指不需對樣品中的化合物進行預選擇,而是采集所有從色譜中分離出的化合物質(zhì)譜信息。目前應用最多的是Waters公司開發(fā)的MSE掃描模式和Thermo Fisher公司軌道離子阱Orbitrap儀器中的全離子碎片掃描模式(AIF)[5]?；赒TOF-MS/MS技術(shù)的MSE全信息串聯(lián)質(zhì)譜采集模式,僅需運行一次分析,即可記錄所有化合物信息,包括高質(zhì)量精度的母離子及其碎片離子信息等,從而極大地提高了篩查效率和準確度,特別適合用于定向和非定向篩查與鑒定復雜樣品中的有毒有害化合物[6-13]。

茶葉是一種基質(zhì)成分復雜的樣品,本文探索建立針對茶葉樣品的大規(guī)模定向篩查檢測方法。通過對購置的農(nóng)藥認證標準物質(zhì)(CRM)分析,建立農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。以固相萃取法為凈化手段,采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)結(jié)合UNIFI軟件進行篩查分析。進行定性方法學驗證,確定每種農(nóng)藥在茶葉樣品中的篩查檢出限(SDL)。最后,應用建立的方法分析了流通市場上部分茶葉的農(nóng)藥殘留情況。本文建立的方法快速、準確、符合成本效益,適用于茶葉中農(nóng)藥殘留快速篩查分析,也為化學污染物殘留的高通量篩查檢測提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Xevo G2-QTOF四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、Acquity UPLC超高效液相色譜儀、MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理操作平臺,UNIFI 1.7.0科學信息學系統(tǒng)(美國Waters公司); Allegra 64R臺式冷凍高速離心機(美國Beckman Coulter公司); Milli-Q Reference超純水機(美國Millipore公司); XS204型電子分析天平,感量為0.000 01 g(瑞士Mettler Toledo公司); JP-100超聲波清洗器(深圳市潔盟清洗設備有限公司)。Cleanert TPT(Triple Phase of Tea SPE)茶葉農(nóng)殘檢測專用固相萃取柱(1 g/6 mL,天津Agela公司)

農(nóng)藥混合標準物質(zhì)(批號CRM42227(含30種農(nóng)藥)、CRM42202(含33種農(nóng)藥)、CRM42230(含21種農(nóng)藥)、CRM42209(含28種農(nóng)藥),濃度均為100 μg/mL,溶劑為乙腈,Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司)均為認證標準物質(zhì)。甲醇、乙腈均為色譜純(西班牙Scharlau公司),甲苯為色譜純(美國Tedia公司),乙酸、乙酸銨均為LC-MS級試劑(美國Anaqua公司)、無水硫酸鈉為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。尼龍66針式濾膜(0.22 μm,天津津騰公司)。氮氣、氬氣(>99.999%)。實驗用水由Milli-Q超純水機制備。

樣品來源與準備:茶葉樣品從流通市場抽取采集,種類包括綠茶、紅茶、白茶、烏龍茶、普洱茶等。樣品采集后即密封置于4 ℃冰箱中,實驗前放至室溫粉碎。

1.2 儀器分析條件

1.2.1UPLC-QTOF-MS條件

UPLC條件 色譜柱Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫45 ℃;流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液(pH 5.0),流動相B為含10 mmol/L乙酸銨的甲醇。洗脫程序:0～0.25 min, 2%B; 0.25～12.25 min, 2%B～99%B; 12.25～13.00 min, 99%B; 13.00～13.01 min, 99%B～2%B; 13.01～15.00 min, 2%B。流速為0.40 mL/min;樣品進樣量為10 μL。

QTOF-MS條件 離子源溫度:120 ℃;脫溶劑氣溫度:550 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:50 L/h;毛細管電壓:0.8 kV;錐孔電壓:20 V;電離模式:ESI正離子模式;掃描模式:分辨率模式。采集模式:MSE模式;質(zhì)量掃描范圍:m/z50～1 200;掃描時間:0.1 s;碰撞能量:低碰撞能量(LE)為4 eV,高碰撞能量(HE)為10～45 eV。LockSpray溶液:亮氨酸腦啡肽(m/z556.277 1),掃描時間0.1 s,間隔30 s。數(shù)據(jù)的采集通過MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理操作平臺完成。

1.2.2UNIFI軟件篩查條件

高能量下響應閾值:20.0；低能量下響應閾值:100.0;背景噪聲過濾強度:高;保留時間最大偏差:0.1 min;精確質(zhì)量偏差閾值:5×10-6;可識別的化合物加合峰形式包括+H、+Na、+K、+NH4峰。碎片(同位素、加合物)質(zhì)量偏差閾值:10 mDa。

1.3 實驗步驟

1.3.1農(nóng)藥質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的建立

采用UPLC-QTOF-MS對農(nóng)藥化合物的混合標準溶液(2.0 mg/L)進行分析,在MSE模式下從低碰撞能量掃描獲得質(zhì)子化分子、相應同位素及加合物的信息,從高碰撞能量掃描獲得主要碎片離子信息。MassLynx軟件采集精確質(zhì)量數(shù)、保留時間等數(shù)據(jù)。將每個化合物的名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子、同位素及加合物等信息制成Excel表格,合并各個化合物結(jié)構(gòu)式的mol文件導入UNIFI軟件,構(gòu)建農(nóng)藥化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

1.3.2樣品前處理

稱取粉碎后的試樣10 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中,加人30 mL乙腈溶液,在均質(zhì)機上以15 000 r/min均質(zhì)1 min, 4 200 r/min離心5 min,收集上清液。殘渣重復提取一次,合并上清液入雞心瓶中,45 ℃旋蒸至近干,加入1 mL乙腈溶解殘余物,待凈化。

在Cleanet TPT柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉,并用5 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)活化固相萃取柱,液面達硫酸鈉頂部時,加入樣品提取液并收集流出物。以25 mL乙腈-甲苯(3∶1, v/v)洗脫目標物,合并洗脫液,45 ℃旋蒸至近干,以1 mL初始流動相溶解殘渣,0.2 μm微孔濾膜過濾后供儀器測定。

1.3.3農(nóng)藥化合物的篩查與鑒定

凈化處理后的樣品在1.2.1節(jié)條件下分析,將采集的數(shù)據(jù)導入UNIFI軟件進行自動譜峰匹配識別,與自建的農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫完成比對。篩查參數(shù)如保留時間、精確質(zhì)量數(shù)的設置參考SANTE/11813/2017指南《食品和飼料中農(nóng)藥殘留分析的方法驗證和質(zhì)量控制程序》[14]。對篩查檢測給出的可疑陽性化合物進行人工鑒定確證,考察其碎片離子等相關(guān)信息,并在網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫上進行檢索比對。

圖 1 有機溶劑中農(nóng)藥混合標準溶液(2.0 mg/L)的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatograms (TICs) of pesticide mixture standard solution at 2.0 mg/L in organic solvent

1.3.4方法學驗證

參考SANTE指南[14]對建立的篩查方法完成方法學驗證,篩查方法的置信度以SDL表示。SDL在指南中定義為已證明在至少95%的樣品中可以檢測到某種分析物(不一定符合明確的鑒定標準)的最低濃度(即接受5%的假陰性率)。

選取21份茶葉空白樣品(其中包括14份綠茶、3份紅茶、2份烏龍茶和2份白茶),分別添加混合標準溶液至4個水平(0.01、0.05、0.10、0.20 mg/kg)后進行前處理和儀器分析。

1.4 實際樣品篩查檢測

選取22份茶葉樣品(其中包括9份綠茶、7份紅茶、4份烏龍茶、1份白茶和1份普洱茶), 應用本文建立的方法進行篩查檢測。每批實際樣品檢測前,運行質(zhì)量控制程序,依次分析標準添加樣品、試劑空白、實際樣品、試劑空白、標準添加樣品。根據(jù)標準添加樣品中隨機挑選的10種農(nóng)藥檢測情況判斷篩查系統(tǒng)是否正常運行。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)庫的建立

由于農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫是為同時進行多種類化合物篩查而創(chuàng)建的,因此盡可能多地涵蓋農(nóng)藥品種非常重要。根據(jù)Krauss等[15]的觀點,使用高分辨質(zhì)譜分析化合物有3種思路:1.有參考標準的定向分析;2.無參考標準的可疑半定向分析;3.非定向分析。本文在第一種思路下進行分析,使用農(nóng)藥參考標準物質(zhì)建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

本文共收集112種標準物質(zhì)(均為CRM認證),品種涵蓋殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑等農(nóng)藥及農(nóng)藥代謝產(chǎn)物。配制質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的農(nóng)藥混合標準溶液,QTOF-MS在預設的低碰撞、高碰撞能量下完成數(shù)據(jù)采集,總離子流圖如圖1所示。收集每個化合物的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子等信息,并與PubChem、MassBank等網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫進行比對。將每個農(nóng)藥化合物的信息匯總導入到UNIFI軟件中。在112種農(nóng)藥中,有23種農(nóng)藥暫時不能在本實驗條件下進行分析,其余91種農(nóng)藥化合物的分子式、單一同位素質(zhì)量、保留時間和主要診斷離子等數(shù)據(jù)見表1。

由表1可知,91種農(nóng)藥化合物中有72種(占總數(shù)的79.1%)采用質(zhì)子化分子作為診斷離子,18種(占總數(shù)的19.8%)采用碎片離子作為診斷離子,1種化合物(殺線威)(占總數(shù)的1.1%)采用鈉加合物作為診斷離子。在大多數(shù)情況下,質(zhì)子化分子豐度最高;少數(shù)情況,無論在低碰撞能量還是高碰撞能量下,目標物碎片離子豐度比質(zhì)子化分子的豐度高很多,選用碎片離子作為診斷離子;個別情況下,鈉加合物為豐度最高的離子。2017年P(guān)atricia等[16]對食品中630種污染物進行多殘留篩查方法研究,發(fā)現(xiàn)約20%的化合物在誘導碰撞解離(CID)產(chǎn)生的碎片比相應的(去)質(zhì)子化分子更豐富,少數(shù)化合物(4%)中鈉或銨加合物被確定為最豐富的離子。

表 1 農(nóng)藥化合物的準確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(包括元素組成、單一同位素質(zhì)量、保留時間和主要診斷離子及其質(zhì)荷比實驗值)

表 1 (續(xù))

2.2 自動篩查參數(shù)的設置、優(yōu)化

在使用數(shù)據(jù)處理軟件進行自動篩查分析時,參數(shù)的優(yōu)化設置對于報告結(jié)果中假陽性和假陰性之間的適度平衡是至關(guān)重要的。假陽性的存在意味著軟件報告了檢出,但隨后無法通過人工驗證程序,其出現(xiàn)會觸發(fā)后續(xù)的鑒定確證流程,造成檢測資源的浪費,影響篩查方法的有效性。假陰性是指化合物在樣品中存在，但未通過篩查與確證程序檢出目標殘留的情況,其出現(xiàn)造成檢測結(jié)果的漏判,影響真實性。在定性篩查工作中,應盡可能降低假陽性誤報的數(shù)量,并保證假陰性的數(shù)量可接受(<5%)[17]。與此同時,如何在流程中盡量減少人工干預,也對參數(shù)的設置提出了更高的要求。

基于DIA的采集模式獲取完整且不受限制的大量數(shù)據(jù)集,其中包括高度卷積的MS/MS譜,這需要用合適的軟件來提取有用的信息。本文使用UNIFI軟件完成這一復雜任務,其數(shù)據(jù)處理分兩步進行:首先進行峰值檢測,然后應用目標篩查參數(shù)匹配識別[18]。本文設置的篩查參數(shù)主要有保留時間最大偏差、目標物(和碎片)精確質(zhì)量偏差閾值、化合物加合峰形式(M+H、M+Na、M+K、M+NH4),具體參數(shù)設置參照1.2.2節(jié)。在實際工作中,對篩查參數(shù)的優(yōu)化是一個工作量很大,并且在一定程度上難以取舍的過程。

保留時間是篩查檢測的重要參數(shù)。保留時間偏差窗口設置太寬可能會產(chǎn)生假陽性誤報,反之,可能會產(chǎn)生假陰性誤報。在篩查過程中發(fā)現(xiàn),與Gómez-Ramos等[19]、Mol等[17]描述一致,在正常適應情況下,色譜系統(tǒng)具有一定的穩(wěn)定性,保留時間的偏差通常不大(小于0.1 min),個別情況下,保留時間會有較大偏差(大于0.1 min)。保留時間產(chǎn)生較大偏差很可能受到基質(zhì)的影響[19],另一方面,色譜環(huán)境也能影響目標物的保留時間,這對儀器設備的使用及維護保養(yǎng)提出了更高的要求。

精確質(zhì)量偏差閾值是篩查檢測的關(guān)鍵參數(shù),為明確的鑒定提供高度的特異性和選擇性。與較低分辨率的質(zhì)譜儀器相比,HRMS精確的質(zhì)量測量可以更加準確地鑒定復雜基質(zhì)中的目標分析物。多數(shù)研究認為,鑒定所要求的質(zhì)量偏差閾值應不超過5×10-6,甚至應更低。2010年Bienvenida等[20]使用LC-TOF-MS測定水果軟飲料中的35種多種農(nóng)藥,其中超過90%的農(nóng)藥質(zhì)量偏差低于2×10-6。在本文研究范圍內(nèi),觀察到有約50%的農(nóng)藥質(zhì)量偏差低于2×10-6。因此基于本文實驗條件,選擇5×10-6作為精確質(zhì)量偏差閾值更為合適。隨著現(xiàn)代儀器設備精度的快速發(fā)展,相信可以用更窄的質(zhì)量偏差閾值分析更多的化合物。除了質(zhì)量偏差和保留時間外,其他參數(shù)(例如加合物、同位素模式)的使用也有助于提高選擇性、降低錯誤檢測率。

2.3 鑒定與確證

分析物的鑒定與確證是對假陽性的評估。SANTE指南[14]中描述“鑒定與確證”需要滿足以下條件:1)至少兩個精確質(zhì)量離子(其中至少有一個碎片離子)質(zhì)量偏差不超過5×10-6; 2)母離子和碎片離子的提取色譜圖保留時間完全重合(基質(zhì)匹配條件下); 3)試樣與標準溶液中離子相對豐度的偏差最好不超過30%。在UNIFI軟件篩查參數(shù)的設置中已經(jīng)涵蓋了鑒定條件的前兩條,并且還增加了加合物離子、同位素模式等參數(shù)。

在軟件給出的篩查結(jié)果中,我們還需手動對可疑檢出化合物進行鑒定與確證。首先,考察可疑檢出化合物的色譜峰形。其次,計算樣品與參考標準的離子相對豐度。另外,除了與參考標準比對外,還可以與PubChem、MassBank等數(shù)據(jù)庫進行檢索比對。

2.4 方法學驗證

對于篩查檢測的定性驗證工作非常繁重,也經(jīng)常被忽視,其驗證過程側(cè)重于可檢測性[14],主要目的是在給定的水平下識別陰性和陽性樣品,確認篩查方法的邊界。本文以SDL作為主要驗證參數(shù)。目前很多國家和國際組織對于茶葉的農(nóng)殘都設定了MRLs,比如日本規(guī)定與茶葉有關(guān)的農(nóng)藥種類有276種,MRLs為0.10～50.0 mg/kg;歐盟規(guī)定的有453種,MRLs為0.01～30.0 mg/kg;我國限量標準GB 2763-2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了483種農(nóng)藥在356種(類)食品中的農(nóng)殘限量。其中有65種涉及茶葉中農(nóng)藥MRLs的規(guī)定,MRLs為0.01～50 mg/kg。本文設置方法學驗證的最低濃度水平為0.01 mg/kg。

茶葉是基質(zhì)復雜的樣品,頻繁篩查分析時須進行充分的驗證[14]。本文從流通市場選取21份茶葉樣品作為空白基質(zhì)樣品進行方法學驗證。在21份茶葉樣品中分別添加混合標準溶液至4個水平(0.01、0.05、0.10、0.20 mg/kg),然后參照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)進行篩查檢測,通過對篩查結(jié)果的分析確定91種農(nóng)藥的SDL,實驗結(jié)果見表2。實驗中要保證≤5%的假陰性率,同一濃度水平需要≥20個樣品檢出陽性方可確定為SDL值。

由表2可知,通過對1 911種農(nóng)藥/樣品組合的評估,發(fā)現(xiàn)有66種農(nóng)藥的SDL為0.01 mg/kg, 8種農(nóng)藥的SDL為0.05 mg/kg, 1種農(nóng)藥的SDL為0.10 mg/kg, 3種農(nóng)藥的SDL為0.20 mg/kg,共有13種農(nóng)藥的SDL大于0.20 mg/kg。

在本文的考察范圍內(nèi),SDL高于0.01 mg/kg的25個農(nóng)藥品種中,噠螨靈的SDL為0.05 mg/kg, GB 2763規(guī)定的MRLs為5 mg/kg,本方法SDL低于GB 2763的MRLs;氟蟲脲、吡蚜酮的SDL都大于0.20 mg/kg, GB 2763規(guī)定的MRLs分別為20、2 mg/kg,這兩個農(nóng)藥品種的SDL還需進一步確定。

部分農(nóng)藥品種的SDL大于0.20 mg/kg,原因可能是由于目標化合物在前處理時損失較大,如滅蠅胺、苯醚氰菊酯、氟蟲脲等。其次,部分目標物在本實驗條件下不能很好地電離,在質(zhì)譜上的響應信號較弱,如茵草敵、苯噻硫氰、乙氧氟草醚、丁草敵等。在本文的考察范圍內(nèi)觀察到,在質(zhì)譜上的響應比較弱的化合物(不僅限于以上提到的幾種化合物),多數(shù)具有在水中溶解度低的化學特性。比如,根據(jù)PubChem數(shù)據(jù),苯噻硫氰的水中溶解度為5.24×10-4mol/L,乙氧氟草醚的水中溶解度為2.98×10-7mol/L,丁草敵的水中溶解度為2.07×10-4mol/L。

2.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應普遍存在于質(zhì)譜分析中,質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應由目標分析物的共提取組分互相作用,影響分析物電離所致,表現(xiàn)為離子增強或抑制作用[21]。針對定性篩查方法,SANTE指南[14]并沒有給出基質(zhì)效應的評價方法。通常,定量檢測的基質(zhì)效應評價方法主要有柱后注射法與提取后添加法[22],本文參考2003年Matuszewski等[23]提出的提取后添加法對定性篩查方法的基質(zhì)效應進行初步評價。選取質(zhì)譜信號較低的3個茶葉樣品作為空白基質(zhì),按照1.3.2節(jié)進行前處理凈化,獲得空白基質(zhì)提取液。分別使用初始流動相和空白基質(zhì)提取液配制4個質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L)的混合標準工作溶液,每個濃度樣品分別平行制備2份,按照1.3.3節(jié)進行篩查分析。

結(jié)果顯示,在91種農(nóng)藥化合物中僅發(fā)現(xiàn)乙氧氟草醚農(nóng)藥有較明顯的基質(zhì)效應。其在流動相溶劑中的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時即可被篩查系統(tǒng)確認檢出,在空白基質(zhì)中需添加標準至2 mg/L才能被篩查系統(tǒng)確認,存在基質(zhì)抑制效應。本文考察基質(zhì)效應的樣品數(shù)量較少,之后還需要在更多樣品基質(zhì)中進行驗證。2014年,Rajski等[24]的研究認為綠茶樣品提取物會產(chǎn)生信號抑制問題,可能會對靈敏度產(chǎn)生負面影響。一般來說,減輕基質(zhì)效應的影響,通常采用稀釋樣品提取液或減少進樣體積等方法[25]。使用離子淌度質(zhì)譜分析也可以有效降低基質(zhì)效應的影響,碰撞截面(CCS)值可用于復雜基質(zhì)的篩查檢測,并且更好地降低了假陽性的出現(xiàn)率[16,26]。

表 2 91種農(nóng)藥在21份不同茶葉樣品中進行定性篩查檢測的方法學驗證結(jié)果

2．6 實際樣品的分析

參考2015年Wang等[9]的方法,在每批實際樣品分析前,進行系列質(zhì)量控制以檢查篩查系統(tǒng)是否正常運行。以0.01 mg/kg水平的基質(zhì)標準添加樣品作為標準添加樣品、提取過程空白樣品作為試劑空白,按照1.4節(jié)描述的順序,分別在實際樣品序列前后進樣檢測。選取非草隆、地胺磷、氟酰胺、吡草醚等10種農(nóng)藥化合物作為驗證參考靶標,同批進入篩查系統(tǒng)分析。確保在前處理過程中沒有引入實驗室污染,篩查系統(tǒng)正常運行。

圖 2 綠茶樣品中吡唑醚菌酯的UPLC-QTOF-MS色譜圖Fig. 2 UPLC-QTOF-MS chromatograms of pyraclostrobin in green tea samples a. [M+Na]+; b. [M+H]+; c. fragment ion m/z 356.07895; d. fragment ion m/z 296.05830; e. fragment ion m/z 194.08195. Acquisition mode: MSE mode; collision energy: LE (low energy) 4 eV; mass extraction window: ±5×10-6.

表 3 綠茶陽性樣品中吡唑醚菌酯的鑒定數(shù)據(jù)

圖2與表3為某品牌碧螺春樣品中吡唑醚菌酯的鑒定與確證結(jié)果。吡唑醚菌酯的分子式為C19H18ClN3O4,在電噴霧正離子模式下可獲得穩(wěn)定的[M+H]+和[M+Na]+加合離子峰,在低碰撞能量下即可裂解成若干碎片離子。由圖2觀察到,吡唑醚菌酯可裂解成3個片段(m/z356.078 95,296.058 30和194.081 95)。[M+H]+離子可脫去CH4O形成m/z356.075 25 [M+H-CH4O]+,或脫去C3H8O3形成m/z296.058 30 [M+H-C3H8O3]+,并進一步裂解形成m/z194.081 95的碎片離子。本文觀察的吡唑醚菌酯裂解情況與MassBank數(shù)據(jù)庫中LC-ESI-QTOF譜圖中描述一致。由圖2可知,[M+H]+離子在色譜圖上的保留時間為10.36,與加鈉離子和3個碎片離子的提取色譜圖完全重疊。診斷離子及碎片離子的精確質(zhì)量和離子相對豐度的偏差見表3, 3個碎片離子精確質(zhì)量的偏差均不超過5×10-6。

3 結(jié)論

本研究介紹了使用UPLC-QTOF-MS對茶葉中91種農(nóng)藥殘留進行定向篩查方法的開發(fā)和驗證,并將其應用于流通市場上茶葉樣品的農(nóng)殘篩查檢測。收集農(nóng)藥參考標準物質(zhì),在MSE模式下進行全信息采集,建立QTOF精確質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。使用軟件完成自動篩查工作,結(jié)合準確質(zhì)量數(shù)、保留時間、碎片離子信息、同位素模式與加合物等信息進行識別,降低錯誤識別出現(xiàn)的風險。參照SANTE指南[14]完成定性篩查方法學驗證。檢查21種不同茶葉中91種農(nóng)藥的篩查可靠性,評估了1 911種農(nóng)藥/商品組合,確定了78種農(nóng)藥的SDL,剩余13種農(nóng)藥SDL大于0.20 mg/kg。在實際樣品測定中發(fā)現(xiàn)流通市場上的部分樣品檢出農(nóng)藥殘留,并進行了鑒定確證。之后的工作中使用三重四極桿質(zhì)譜儀將篩查出的污染物納入定量分析的監(jiān)測程序中。這個例子清楚地表明,如果沒有全面篩查方法,可能會導致低估食品中存在的農(nóng)藥及代謝物殘留總量的風險。

本文在質(zhì)譜的正離子模式下考察部分農(nóng)藥化合物,之后還將在負離子模式下建立分析方法。如今,分析儀器技術(shù)的飛速發(fā)展,對分析的準確度與靈敏度都提出了更高要求。HRMS提供高分辨率、高全掃描靈敏度和選擇性,使其對食品中的污染物的殘留分析極具吸引力。更多的實驗工作使HRMS的研究范圍擴展到其他類型的污染物,或是進行非目標殘留物篩查,但隨之也必須匹配適當和切實可行的質(zhì)量控制程序。規(guī)?；暮Y查、鑒定與量化終將在單次常規(guī)分析中融合。