高通量固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人尿中8種環(huán)境酚類內(nèi)分泌干擾物

林 瀟, 邱 天, 張 續(xù), 胡小鍵, 楊艷偉, 朱 英

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與人群健康重點實驗室, 中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

雙酚類(bisphenols)和三氯生(triclosan)是兩類重要的環(huán)境酚類(environmental phenols)化合物,被廣泛用于塑料、食品接觸涂層、個人護(hù)理品、藥物等各類工業(yè)和消費產(chǎn)品中[1-3]。隨著這些產(chǎn)品的大量使用,近年來在世界范圍內(nèi)的土壤、空氣、室內(nèi)灰塵、飲用水、食品及生物樣本中均可檢出這些物質(zhì)[4-8]。研究顯示,雙酚類、三氯生等物質(zhì)在一定程度上具有與持久性有機(jī)污染物相類似的“持久性、生物富集性和生物毒性”,是潛在的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[9,10]。人群流行病學(xué)研究顯示這些物質(zhì)的暴露與多種人類疾病顯著相關(guān),如肝損傷[11]、甲狀腺功能障礙[12]、卵巢功能障礙[13,14]、肥胖促進(jìn)作用[15]等。因此,目前已有多個國家對這些物質(zhì)的使用進(jìn)行限制[2,16]。

日常生活中,人們可通過呼吸、飲水、皮膚吸收等多途徑攝入環(huán)境酚。為更準(zhǔn)確地評估這些化合物的人群暴露水平,人體生物監(jiān)測被認(rèn)為是最為理想的暴露監(jiān)測及評估手段。目前,美國、德國、加拿大等國家亦均對本國居民開展了大范圍的生物監(jiān)測工作,以評估環(huán)境酚類化合物暴露的健康風(fēng)險。建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的分析方法對于開展環(huán)境酚類物質(zhì)的內(nèi)暴露監(jiān)測及評估十分重要。

環(huán)境酚進(jìn)入人體后,在體內(nèi)的半衰期較短(4～24 h)[17,18],經(jīng)葡萄糖苷酸化代謝后,由腎臟排出體外[19]。因此,通常將尿中環(huán)境酚的濃度作為評估人體內(nèi)暴露的依據(jù)[20]。目前,國外主要采用美國疾控中心建立的在線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Online SPE-HPLC-MS/MS)法對尿中的環(huán)境酚類化合物進(jìn)行測定[21]。該方法的局限性在于在線固相萃取裝置在我國普及率不高,無法在我國推廣應(yīng)用。國內(nèi)多采用離線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定尿樣中的環(huán)境酚類化合物[22,23],該方法存在的問題主要包括前處理的效率低、溶劑用量大、樣品需求量較大、實驗過程中空白較高,影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外,還有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[24],該方法需要對酚類化合物進(jìn)行衍生化,過程比較繁瑣。

基于此背景,本研究建立了8種環(huán)境酚類化合物的96孔板離線固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(96-well SPE LC-MS/MS)測定方法。該方法操作簡便,定量準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,樣品處理效率高,空白干擾小,少量樣品即可滿足分析要求,適用于大批量尿樣中常見的8種環(huán)境酚類化合物的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(TQ-XS,美國沃特世公司),配有I-Class Plus超高效液相色譜儀;Cascada超純水機(jī)(美國波爾公司); 96孔板固相萃取裝置(美國沃特世公司)。Oasis HLB 96孔板(60 mg)購于美國沃特世公司。96孔板離心機(jī)(MPC2000,北京鼎昊源科技有限公司)。

雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、四溴雙酚A(TBBPA),純度均大于98.5%,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;四氯雙酚A(TCBPA),純度大于97%,購自美國Accustandard公司;雙酚S(BPS)、雙酚AF(BPAF)、雙酚B(BPB)和三氯生(TCS)的質(zhì)量濃度均為100 μg/mL,購于美國劍橋同位素實驗室。雙酚A內(nèi)標(biāo)(BPA-d16, 1 mg/mL)、四氯雙酚A內(nèi)標(biāo)(TCBPA-13C12, 50 μg/mL)、四溴雙酚A內(nèi)標(biāo)(TBBPA-13C12, 50 μg/mL)、雙酚S內(nèi)標(biāo)(BPS-13C12, 100 μg/mL)、雙酚B內(nèi)標(biāo)(BPB-13C12, 100 μg/mL)、雙酚AF內(nèi)標(biāo)(BPAF-13C12, 100 μg/mL)和三氯生內(nèi)標(biāo)(TCS-13C12, 100 μg/mL)純度均為98%,購于美國劍橋同位素實驗室。雙酚F內(nèi)標(biāo)(BPF-d10, 1 mg/mL),純度98%,購自Toronto Research Chemicals。

乙酸銨、乙酸(MS級,美國賽默飛公司);水、甲醇和乙腈(MS級,德國默克公司)。2 mL玻璃進(jìn)樣小瓶(美國沃特世公司)。β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶購于美國西格瑪公司。Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)購于美國沃特世公司,標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM 3672(美國NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。人工尿樣購于湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

用甲醇將固體標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度約為100 mg/L的單標(biāo)儲備液。各取一定體積的單標(biāo)儲備液,用甲醇定容至10 mL,其中,TCS質(zhì)量濃度為40 mg/L,其余7種物質(zhì)均為10 mg/L。用甲醇逐級稀釋得到混合標(biāo)準(zhǔn)序列溶液。

分別取適量各內(nèi)標(biāo)溶液,用甲醇稀釋,配制質(zhì)量濃度分別為2.5 mg/L (BPA-d16)、5 mg/L(BPF-d10)、1 mg/L(TCS-13C12)以及0.5 mg/L(其余內(nèi)標(biāo))的內(nèi)標(biāo)混合溶液。

表 2 8種目標(biāo)化合物及同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液:臨用時,分別取50 μL各濃度的標(biāo)準(zhǔn)序列溶液,加入50 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液和400 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,配制得到質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液(TCS的質(zhì)量濃度為0、0.4、2、4、10、20、40、100、200 μg/L)。

工作曲線溶液:向9支5 mL離心管中分別加入1 mL人工尿樣,加入50 μL各濃度的標(biāo)準(zhǔn)序列溶液,50 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液,30 μLβ-葡萄糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶和700 μL乙酸銨緩沖溶液(1 mol/L, pH=5.0),與樣品一起前處理后,用0.5 mL 50%(v/v)甲醇水溶液復(fù)溶,工作曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的質(zhì)量濃度一致。

1.3 樣品前處理

從-80 ℃冰箱中取出冷凍尿樣,在4 ℃冰箱中解凍12 h再放置至室溫,充分渦旋振蕩后取1 mL,加入50 μL內(nèi)標(biāo)混合液、800 μL乙酸銨緩沖溶液和30 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃水浴過夜酶解。酶解后的尿樣離心(3 000 r/min)后取上清液上樣。依次用2 mL甲醇、2 mL水和1 mL乙酸銨緩沖溶液活化平衡固相萃取小柱,然后取樣品上清液上樣,用1 mL 25%(v/v)乙腈進(jìn)行淋洗,用2 mL甲醇洗脫。洗脫液經(jīng)氮氣吹干,用0.5 mL甲醇-水(1∶1, v/v)溶液復(fù)溶,混勻后在4 400 r/min下離心10 min后進(jìn)樣。

為降低空白干擾,實驗所用器具均為玻璃材質(zhì),每一批樣品做1個工作曲線、2個過程空白和2個質(zhì)控樣(NIST SRM 3672)(吸煙者尿樣)。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

超高效液相色譜柱:Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動相:A相為水;B相為乙腈。進(jìn)樣量5 μL。柱溫40 ℃。流動相梯度見表1。

表 1 UPLC流動相梯度

表 2 (續(xù))

表 3 3種固相萃取柱對BPF和TCS的加標(biāo)回收率

以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以內(nèi)標(biāo)法計算8種目標(biāo)化合物的含量。

1.5 質(zhì)量控制

實驗中應(yīng)盡可能使用玻璃材質(zhì)的器皿,以降低背景干擾。每批樣品檢測時,每10～15個樣品附帶1個質(zhì)控樣品和1個空白樣品,用以保證方法的準(zhǔn)確性和監(jiān)控實驗中產(chǎn)生的空白污染,同時隨機(jī)抽取未知樣品(10%數(shù)量)進(jìn)行重復(fù)測定,用以確保方法的精密度。重復(fù)測定樣品的RSD不應(yīng)高于30%。

1.6 樣品的采集和儲存

采集的尿樣應(yīng)儲存在硼硅酸鹽玻璃或聚丙烯材質(zhì)的采樣瓶中,使用特氟龍材質(zhì)的蓋子。采樣前對采樣材料進(jìn)行空白實驗篩查,確認(rèn)不含測定的目標(biāo)物。在樣品采集的過程中,同時制備3套樣品空白。樣本采集后,于-20 ℃冷凍,并儲存在干冰中運輸。在實驗室中,樣本在-80 ℃冰箱中保存。在樣品分析的同時分析采樣空白(采樣地水樣)、過程空白(50 μL內(nèi)標(biāo)混合液、800 μL乙酸銨緩沖溶液和30 μL葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶),以了解和控制樣品采集、存儲和分析過程中的污染。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1固相萃取柱的選擇

分別考察Oasis HLB 96孔板(60 mg)、Oasis HLB 96孔板(30 mg)和Prime HLB 96孔板(30 mg)的目標(biāo)物回收率。其中,Prime HLB 96孔板不需要活化即可直接上樣,但填料中有BPA殘留,需要清洗填料以免產(chǎn)生空白。Prime HLB 96孔板(30 mg)和Oasis HLB 96孔板(30 mg)對BPF和TCS的回收率均不如Oasis HLB 96孔板(60 mg)(如表3所示),其他化合物的回收率沒有顯著差別。因此,最終選擇Oasis HLB 96孔板(60 mg)作為本實驗的固相萃取柱。

2.1.2淋洗條件的選擇

本研究考察了甲醇、乙腈等常用有機(jī)溶劑對淋洗效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)使用30%(v/v)甲醇水溶液時,BPS、BPF和BPA損失比較嚴(yán)重,而使用30%(v/v)乙腈水溶液時,各目標(biāo)物的損失最小且洗脫液的基質(zhì)干擾效應(yīng)也最小。這可能是因為甲醇的極性強(qiáng)于乙腈,目標(biāo)物在甲醇中的溶解性更好,洗脫過程中更易損失。在此基礎(chǔ)上比較了不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈水溶液對淋洗效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在使用30%乙腈作為淋洗液的時候,總體的回收率好,基質(zhì)干擾效應(yīng)最小。因此,選擇30%乙腈作為本實驗的淋洗液。

2.1.3過程空白的考察

BPA廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域,在各種環(huán)境介質(zhì)中均普遍存在,因此,實驗過程中采用的各種試劑、耗材,甚至是超純水和MS級的水中都有可能檢出,很難完全避免BPA檢測過程中的過程空白,只能盡量降低。本實驗對容器、試劑、耗材、儀器和實驗殘留等方面進(jìn)行空白測定。結(jié)果顯示,空白主要來源于試劑、耗材及實驗殘留。其中,實驗過程中使用的乙酸銨緩沖溶液經(jīng)常能夠檢出BPA并不可避免,通過使用MS級試劑能夠有效降低空白值。每批次使用的離心管和移液槍頭需進(jìn)行空白值評估,無目標(biāo)物檢出方可進(jìn)行使用。在長期測定的環(huán)境中,容易產(chǎn)生目標(biāo)物殘留,因此在實驗后對裝置和環(huán)境進(jìn)行及時清洗非常重要。每次實驗應(yīng)控制實驗過程空白,實驗過程空白應(yīng)低于方法檢出限方可使用實驗測定數(shù)據(jù)。

實驗比較了相同條件下,使用96孔板和固相萃取小柱進(jìn)行固相萃取時產(chǎn)生的空白值大小。由于96孔板使用的溶劑量更少,BPA的空白值低于0.05 μg/L, BPS的空白值低于0.004 μg/L,均低于使用固相萃取小柱所引入的過程空白(BPA: 0.2 μg/L; BPS: 0.006 μg/L),說明96孔板不僅能夠高通量處理樣品,還可以有效降低過程空白的引入。

圖 1 實際尿樣中BPA m/z 227/212離子對的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of m/z 227/212 channel of BPA in a real urine sample

圖 2 8種環(huán)境酚類化合物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the eight environmental phenols

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1分析柱的選擇

對比了Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)對樣品中目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明,使用T3色譜柱時,不僅目標(biāo)物的峰形不好,而且在實際樣品分析時,在BPA的227/212離子對色譜目標(biāo)峰位置存在干擾峰,使用C18色譜柱時,目標(biāo)峰和干擾峰的分離效果則更好(見圖1)。因此,最終選擇C18色譜柱作為本研究的分析柱。

2.2.2色譜條件的選擇

本研究比較了甲醇和乙腈作為有機(jī)流動相時各目標(biāo)物的分離效果和峰形。結(jié)果顯示,二者的分離效果相當(dāng),但當(dāng)使用水和乙腈作為流動相時,各目標(biāo)物的峰形好,拖尾現(xiàn)象更少,因此采用水和乙腈作為流動相。

比較了以50%水相、60%水相、70%水相和80%水相作為初始流動相時,各目標(biāo)物的分離效果,并以質(zhì)控樣NIST SRM 3672評價BPA和TCS的定量準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn),使用80%水相為初始流動相時能更好地分離雙酚A的目標(biāo)峰和干擾峰,測定結(jié)果更準(zhǔn)確。使用高比例的水相還能夠清洗樣品中鹽類的干擾,減少質(zhì)譜污染,降低基質(zhì)效應(yīng)。另外,TCBPA、TBBPA和TCS的出峰時間比較接近,水相比例高也有助于提高這3個目標(biāo)物的分離度,增加各目標(biāo)物的掃描時間,提高響應(yīng)強(qiáng)度。在80%水相作為初始流動相時8種環(huán)境酚類目標(biāo)物的色譜圖見圖2。

2.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)

由于無法獲得不含此8種環(huán)境酚類化合物的實際尿樣基質(zhì),本方法用人工尿樣代替實際尿樣,用于評估計算絕對基質(zhì)效應(yīng)。分別用人工尿樣和甲醇溶液配制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(不含內(nèi)標(biāo)),人工尿樣配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行前處理,與甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線共同上機(jī)測定,根據(jù)文獻(xiàn)[25,26]方法對絕對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行計算評估。結(jié)果顯示,BPA、BPF、BPS、BPB和BPAF的|ME|范圍為3.47%～15.32%,為弱基質(zhì)效應(yīng),不需要采取補(bǔ)償措施;TCBPA的|ME|為49.58%,為中等程度基質(zhì)效應(yīng);TBBPA和TCS的|ME|分別為71.99%和86.93%,為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),中等基質(zhì)效應(yīng)和強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)均需采取措施補(bǔ)償。因此,本方法采用同位素內(nèi)標(biāo)法抵消基質(zhì)效應(yīng)。通過考察用人工尿樣和甲醇溶液配制的兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(含內(nèi)標(biāo)),再次評估絕對基質(zhì)效應(yīng),8種環(huán)境酚類化合物的|ME|范圍為1.51%～17.27%,說明TCBPA、TBBPA和TCS的基質(zhì)效應(yīng)得到了有效補(bǔ)償。

選取6份不同來源的實際尿樣,經(jīng)上述方法前處理后,得到6份實際尿樣基質(zhì)。分別取490 μL實際尿樣基質(zhì),加入10 μL 100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)。計算這8種內(nèi)標(biāo)的峰面積的RSD,用于評估相對基質(zhì)效應(yīng)[25,27]。這8種化合物在不同來源的尿樣基質(zhì)中的質(zhì)譜響應(yīng)穩(wěn)定,內(nèi)標(biāo)峰面積的RSD分別為4.35%(BPA)、7.83%(BPF)、8.07%(TCBPA)、9.06%(TBBPA)、3.63%(BPS)、5.50%(BPAF)、4.12%(BPB)和5.32%(TCS),說明相對基質(zhì)效應(yīng)穩(wěn)定?；|(zhì)效應(yīng)評估的結(jié)果說明,在進(jìn)行定量檢測時,可以用標(biāo)準(zhǔn)曲線代替基質(zhì)匹配工作曲線。

2.4 線性范圍和檢出限

以目標(biāo)物峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對相應(yīng)濃度X(μg/L)進(jìn)行線性回歸,8種目標(biāo)化合物在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。參照文獻(xiàn)[28],根據(jù)美國環(huán)保署(US EPA)檢出限測定程序第2版[29],采用兩種方法考察檢出限:①對有空白干擾的目標(biāo)物(BPA、BPS、TCS、TCBPA和BPAF),利用7次過程空白的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限;②對沒有空白干擾的目標(biāo)物,用不含本底的尿樣預(yù)估方法定量限加標(biāo)(7次),以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算檢出限。再以3.3倍檢出限計算所有目標(biāo)物的定量限?？紤]到樣品中目標(biāo)物的濃度在前處理時濃縮了2倍,本方法的檢出限為0.002～1.09 μg/L,定量限為0.007～3.63 ng/L。線性方程與檢出限的結(jié)果見表4。

表 4 8種環(huán)境酚類化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表 5 8種目標(biāo)化合物在3個水平下的加標(biāo)回收率及RSD(n=5)

2.5 方法的回收率和精密度

選用接近空白的實際尿樣進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗,加標(biāo)水平分別為2.5、5和25 μg/L,每個水平進(jìn)行5次平行實驗,計算加標(biāo)回收率和日內(nèi)精密度。在不同天對實際尿樣進(jìn)行分析測定,以計算日間精密度。結(jié)果見表5。

2.6 準(zhǔn)確性驗證

采用NIST SRM 3672進(jìn)一步評價該方法的準(zhǔn)確性。用該方法對SRM 3672進(jìn)行檢測,與其認(rèn)證的2種物質(zhì)的濃度進(jìn)行比較。認(rèn)證含量通過將分析證書中的含量(μg/kg)通過尿密度(1.019 g/mL)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度(μg/L)。

如表6所示,該方法對BPA和TCS的檢測結(jié)果與認(rèn)證的濃度一致,進(jìn)一步驗證了該方法的準(zhǔn)確性。

表 6 SRM 3672平均測定含量與認(rèn)證含量(n=6)Table 6 Average measured contents and certified contents of SRM 3672 (n=6)CompoundContents/(μg/L)This methodNIST certifiedBPA2.753.11TCS17.818.0 NIST: National Institute of Standard and Technology.

2.7 實際樣品的檢測

采用本方法對北京市2019-2020年采集的64份尿樣進(jìn)行檢測分析,結(jié)果(見表7)表明,本批尿樣除BPB和BPAF未檢出外,其余均有檢出,BPA的檢出率最高,為100%。在幾何平均數(shù)(GM)的計算中,低于LOD的值均用LOD/2值代替。測定結(jié)果顯示,人尿中BPA和TCS的含量相對較高,中位值分別為0.69和1.44 μg/L。BPS的檢出率為96.9%,中位數(shù)為0.086 μg/L。其他酚類化合物的存在水平均較低。以上結(jié)果表明,北京市居民存在普遍的環(huán)境酚類化合物暴露,值得關(guān)注。

表 7 8種環(huán)境酚類化合物在人尿中的測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了尿中8種環(huán)境酚類化合物高通量固相萃取-UPLC-MS/MS分析方法。相比傳統(tǒng)固相萃取方法,該方法操作更加簡單,能有效提高樣品處理效率,可降低實驗中引入的空白并減少人員與有害試劑的接觸,適合尿中多種環(huán)境酚類物質(zhì)的大批量檢測。