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    塞來昔布對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大及MAPK/ERK通路的影響

    2020-11-02 13:21:08鄭香妮侯敏
    中國老年學(xué)雜志 2020年20期
    關(guān)鍵詞:塞來中總表面積

    鄭香妮 侯敏

    (1慶陽市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,甘肅 慶陽 74500;2武漢市東西湖區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科)

    心肌細(xì)胞肥大表現(xiàn)為細(xì)胞表面積增加和細(xì)胞中總蛋白合成增加,心臟通過心肌細(xì)胞肥大增加心輸出量,是病理初期一種強(qiáng)有力的代償形式,但持續(xù)的心肌肥大會引起心肌收縮功能紊亂、心室重構(gòu)等,最終導(dǎo)致心力衰竭而威脅患者生命健康〔1,2〕。因此抑制心肌肥大對改善心功能具有重要臨床意義。研究表明,環(huán)氧化酶-2抑制劑可通過影響血壓、氧化應(yīng)激等抑制心肌肥大,塞來昔布作為環(huán)氧化酶-2抑制劑的一種,塞來昔布可能在心肌肥大臨床輔助治療中發(fā)揮有效作用〔3,4〕。但其抑制心肌肥大的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究利用血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大,觀察塞來昔布對心肌細(xì)胞表面積、總蛋白濃度及細(xì)胞凋亡率的影響,并探討其對細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路的影響。

    1 材料與方法

    1.1細(xì)胞系及主要試劑 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(北納生物,編號:BNCC337766),塞來昔布(美國輝瑞公司,批號:J20120063),AngⅡ(美國Sigma公司,純度>98%),胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。

    1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取H9c2細(xì)胞在37℃水浴快速解凍,加入5 ml DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄上清,加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,加入100 kIU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素,放于37℃,5%CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到90%以上時,進(jìn)行細(xì)胞傳代。棄培養(yǎng)基,使用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗細(xì)胞后,加入1 ml 0.25%胰酶消化細(xì)胞,顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓,有細(xì)胞開始脫離瓶壁時,加入5 ml DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞移入無菌離心管中,1 000 r/min離心5 min,棄上清,重懸細(xì)胞后,轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,放于37℃,5%CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3藥物處理及分組 取上述傳代后對數(shù)生長期的細(xì)胞,以1×104個/孔的密度加入96孔板中,以6×105個/皿的密度加入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,將細(xì)胞分為5組:空白組(未加任何藥物處理);AngⅡ組(加入1 μmol/L的AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大);AngⅡ+塞來昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L組(先加入1 μmol/L的AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大,后分別加入塞來昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L處理)。各組細(xì)胞放于37℃,5%CO2的無菌恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

    1.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞表面積測定 棄掉96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液,加入PBS沖洗細(xì)胞后,在奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。每孔加入100 μl的0.1%Triton溶液,室溫作用5 min以增加細(xì)胞膜通透性,吸去Triton溶液,加入PBS沖洗3次。每孔加入100 μl的1%牛血清白蛋白(BSA)溶液,37℃下封閉30 min。吸去BSA溶液,加入50 μl BSA溶液稀釋的β-肌動蛋白(β-actin)抗體一抗(Abcam公司),以PBS代替一抗作為陰性對照,4℃孵育過夜,清洗細(xì)胞后,加入50 μl BSA溶液稀釋的羅丹明標(biāo)記二抗(Abcam公司),室溫避光孵育1 h。洗滌細(xì)胞,加入50 μl 4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)溶液室溫避光染色10 min,清洗細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察并拍照,隨機(jī)選擇10個細(xì)胞,使用NIH圖像分析軟件計算細(xì)胞表面積。

    1.5細(xì)胞總蛋白濃度測定 收集各組細(xì)胞,加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)震蕩混勻,冰上放置30 min,12 000 r/min離心10 min,吸取上清液加入新的無菌離心管中,使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)檢測各組細(xì)胞中總蛋白濃度。

    1.6細(xì)胞凋亡測定 棄掉96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液,加入PBS沖洗細(xì)胞后,加入預(yù)冷的20%乙醇固定24 h,離心收集細(xì)胞并用PBS沖洗3次。參照Annexin-V/碘化丙啶(PI)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)說明,先加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,再分別加入5 μl Annexin-V和10 μl PI渦旋混勻,室溫避光反應(yīng)10 min。使用BD LSRFortessa X-20流式細(xì)胞儀(New Discovery公司)檢測各組細(xì)胞凋亡率。

    1.7細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2、磷酸化(p)-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)檢測 收集培養(yǎng)皿中細(xì)胞,加入預(yù)冷的PBS反復(fù)沖洗2次,加入1 ml RIPA裂解液吸打混勻,提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白,低溫下轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,封閉2 h。加入1∶1 000稀釋后的p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK抗體一抗(Abcam公司),4℃孵育過夜。加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記二抗(Abcam公司),室溫孵育1 h,PBS洗膜3次。加入電化學(xué)發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司)中顯色后,放入GelDoc-ItT S3全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP)下曝光、拍照。以GAPDH為對照,應(yīng)用Image J軟件分析各組細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量。

    1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1塞來昔布對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 正常H9c2心肌細(xì)胞呈肌細(xì)胞樣貼壁生長,與空白組比較,AngⅡ組細(xì)胞形態(tài)增大,不規(guī)則排列,細(xì)胞貼壁不牢,漂浮細(xì)胞增多;與AngⅡ組比較,塞來昔布各處理組細(xì)胞形態(tài)變小,漂浮細(xì)胞減少。見圖1。

    2.2塞來昔布對細(xì)胞表面積的影響 與空白組比較,AngⅡ組細(xì)胞表面積明顯增大(P<0.05);與AngⅡ組比較,塞來昔布處理各組細(xì)胞表面積明顯減小(P<0.05);AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和塞萊昔布100 mg/L組細(xì)胞表面積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均顯著大于空白組(P<0.05);與AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組比較,AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組細(xì)胞表面積明顯減小(P<0.05),與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表1。

    2.3塞來昔布對細(xì)胞中總蛋白濃度的影響 與空白組比較,AngⅡ組細(xì)胞中總蛋白濃度明顯升高(P<0.05);與AngⅡ組比較,塞來昔布處理各組細(xì)胞中總蛋白濃度明顯降低(P<0.05);AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組細(xì)胞中總蛋白濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均高于空白組(P<0.05);AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組細(xì)胞中總蛋白濃度較AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組明顯降低(P<0.05),與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    2.4塞來昔布對細(xì)胞凋亡率的影響 與空白組比較,AngⅡ組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與AngⅡ組比較,塞來昔布各處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05);隨塞來昔布濃度增加,細(xì)胞凋亡率呈逐漸降低趨勢(P<0.05)。見表1和圖3。

    2.5塞來昔布對細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較,AngⅡ組細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量均明顯降低(P<0.05);與AngⅡ組比較,塞來昔布各處理組細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)學(xué)意義(P>0.05),但p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量均明顯增加(P<0.05),且AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組細(xì)胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量明顯高于AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組(P<0.05)。見表2和圖4。

    圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(×100)

    圖2 細(xì)胞熒光染色(DAPI,×400)

    表1 各組細(xì)胞表面積、總蛋白含量及細(xì)胞凋亡率比較

    圖3 細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

    表2 各組細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達(dá)量比較

    1~5:空白組;AngⅡ組;AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組;AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組;AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組

    3 討 論

    機(jī)械刺激、化學(xué)等因素刺激下均可導(dǎo)致心肌蛋白合成增加,心肌細(xì)胞體積增大,而發(fā)生心肌肥大,研究表明,心肌肥大是許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中共有的病理過程,是導(dǎo)致心力衰竭的獨(dú)立危險因素〔5,6〕。研究表明,靶向心肌肥大是預(yù)防及治療心力衰竭的新的有效手段〔7〕。AngⅡ是調(diào)節(jié)血壓和體液的重要激素,可通過升高血壓或直接刺激心肌細(xì)胞合成肌蛋白增加,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大〔8,9〕。

    塞來昔布是一種環(huán)氧化酶2抑制劑,動物實驗表明,心肌細(xì)胞環(huán)氧化酶2的高表達(dá)可導(dǎo)致心肌肥厚顯著增加,而塞來昔布治療可不同程度緩解心肌肥大及心肌收縮功能障礙,延緩心肌肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變,降低死亡率〔10,11〕。本研究說明塞來昔布對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有抑制作用,與Wang等〔12〕研究結(jié)果基本一致。進(jìn)一步分析說明塞來昔布對心肌肥大的抑制具有劑量依賴性,

    心肌細(xì)胞肥大凋亡、心肌纖維化導(dǎo)致心肌收縮和舒張功能障礙,心室順應(yīng)性增加是慢性心力衰竭的重要病理改變〔13,14〕。Zhang等〔15〕研究報道,塞來昔布通過減少細(xì)胞凋亡、降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平,抑制壓力超載誘導(dǎo)的心肌肥大。本研究提示塞來昔布可能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡而抑制心肌肥大。p38MAPK和ERK1/2是MAPK/ERK信號通路的主要組成部分,MAPK/ERK信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的重要信號系統(tǒng)〔16,17〕。本研究提示塞來昔布可促進(jìn)p38MAPK和ERK1/2磷酸化,激活MAPK/ERK信號通路,這可能與塞來昔布抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

    綜上,塞來昔布能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大,蛋白生成,有效抑制心肌細(xì)胞肥大。此外其可能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞中p38MAPK、ERK1/2磷酸化,激活MAPK/ERK信號通路,抑制心肌細(xì)胞凋亡,在抑制心肌肥大進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。

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