槐角黃酮通過(guò)調(diào)控miR-188-5p/PRMT5基因表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制

侯從嶺 雷小婷 蘆曉帆 周超鋒 李彬

(1河南省中醫(yī)院肺病科，河南 鄭州 450002；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院肺病科；3河南省中醫(yī)院腫瘤科)

肺癌發(fā)病率和死亡率在世界各地均在上升，肺癌的發(fā)生與吸煙飲酒密切相關(guān)〔1〕。大多肺癌患者確診時(shí)已是晚期，癌癥已發(fā)生轉(zhuǎn)移，腦轉(zhuǎn)移患者平均生存時(shí)間僅1～2個(gè)月，放化療等方法預(yù)后較差，患者負(fù)擔(dān)重〔2〕。中藥因可延長(zhǎng)患者生存期并改善患者生存質(zhì)量，已成為肺癌治療的重要組成部分〔3〕?；苯屈S酮可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3及下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2來(lái)抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔4〕。與癌旁組織相比，miR-188-5p在胃癌組織、前列腺癌和肝癌組織及細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-188-5p可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移或促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡〔5～7〕。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)5在肺癌、胃癌及肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，干擾或下調(diào)PRMT5表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖〔8～10〕。但槐角黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞的影響及機(jī)制尚不清楚。本研究以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，研究槐角黃酮對(duì)肺癌的影響及miR-188-5p和PRMT5在此機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)；槐角購(gòu)自中藥批發(fā)市場(chǎng)；胰蛋白酶Trypsin、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞砜(DMSO)和四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；F-12K培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；Transwell板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；抗PRMT5抗體、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、抗MMP-9抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自Abcam；顯微鏡、發(fā)光儀、酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理 細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基中，置于濕度保持95%、37℃且5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化傳代。藥物處理：槐角黃酮采用文獻(xiàn)〔11〕方法提取和制備。將槐角黃酮以10 mg/ml的質(zhì)量濃度溶解于F-12K培養(yǎng)基中，并稀釋成1 mg/ml和5 mg/ml，過(guò)濾除菌。96孔板培養(yǎng)細(xì)胞至貼壁狀態(tài)，將培養(yǎng)液吸出，換為含不同濃度槐角黃酮的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將傳代后的A549細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋至(1～2)×106個(gè)細(xì)胞/ml，以2×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至融合度為80%～90%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取等體積用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋的脂質(zhì)體和各組片段及載體，混合均勻，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的A549細(xì)胞中，混勻，培養(yǎng)6 h，換為F-12K完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 收集各組轉(zhuǎn)染或(和)槐角黃酮處理的A549細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，合成的cDNA測(cè)定濃度和純度后置于-80℃保存。取cDNA按照real-time PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 45 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。引物如下：miR-188-5p：5′-CATCCCTTGCATGGTGGAGGG-3′；PRMT5上游：5′-CCTGTGGAGGTGAACACAGT-3′，下游：5′-AGAGGATGGGAAACCATGAG-3′。運(yùn)用Bio-Rad PCR系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集轉(zhuǎn)染或處理后的A549細(xì)胞，消化，稀釋細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于96微孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)上清，每孔再加入150 μl DMSO，室溫混勻5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 吸光度(A)值。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染或處理后的各組A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，加入含10 g/L BSA的無(wú)血清F-12K培養(yǎng)基，將細(xì)胞稀釋為2×105個(gè)/ml。Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μl含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基，Transwell上層小室中加入100 μl細(xì)胞，將上層小室放入下層培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)48 h，取出用棉簽拭去基質(zhì)膠和上層小室的細(xì)胞，冰甲醛固定細(xì)胞，染色，顯微鏡計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：以4℃無(wú)血清培養(yǎng)基1∶3比例稀釋Matrigel，加入上層Transwell小室，烘干，以下步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，上層加入100 μl稀釋的細(xì)胞，下層加入500 μl含10%FBS的F-12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，固定細(xì)胞，染色，計(jì)數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，Trypsin消化，計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24～48 h，觀察若細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的PRMT5的野生型(WT-PRMT5)和突變型(MUT-PRMT5)雙熒光素酶報(bào)告載體分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-188-5p，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入裂解液室溫裂解30 min，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組A549細(xì)胞用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液裂解，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白并檢測(cè)濃度。將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加入一抗，抗PRMT5抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶500)、p21抗體(1∶800)、抗MMP-2抗體(1∶500)、抗MMP-9抗體(1∶800)和抗GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。洗膜2次，然后加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1槐角黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響 與對(duì)照組相比，槐角黃酮1 mg/ml組、5 mg/ml組和10 mg/ml組肺癌細(xì)胞A549的增殖蛋白CyclinD1表達(dá)明顯下降，p21表達(dá)明顯上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著下降，細(xì)胞抑制率顯著上升，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(均P<0.05)，且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴趨勢(shì)。見(jiàn)圖1，圖2，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖2 槐角黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶柴染色，×200)

表1 槐角黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

2.2槐角黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞中miR-188-5p和PRMT5表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，槐角黃酮1 mg/ml組、5 mg/ml組和10 mg/ml組A549細(xì)胞中miR-188-5p表達(dá)水平顯著上升，PRMT5 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下降(均P<0.05)。見(jiàn)表2，圖3。

表2 槐角黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞中miR-188-5p和PRMT5表達(dá)的影響

圖3 Western印跡檢測(cè)PRMT5蛋白表達(dá)

2.3miR-188-5p靶向調(diào)控PRMT5的表達(dá) PRMT5的3′-UTR序列中含有與miR-188-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖4A。與miR-NC組(1.00±0.09，n=6)相比，miR-188-5p組野生型WT-PRMT5的螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性顯著下降(0.32±0.03，n=6，t=17.558,P=0.000)；而突變型MUT-PRMT5的螢火蟲(chóng)熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯變化(miR-NC組0.98±0.08、miR-188-5p組0.99±0.09，n=6，P>0.05)。與miR-NC組(0.61±0.03,n=12)相比，miR-188-5p組的PRMT5蛋白表達(dá)量顯著下降(0.23±0.03,n=12,P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.60±0.06，n=12)相比，anti-miR-188-5p組的PRMT5蛋白表達(dá)量顯著上升(0.95±0.08，n=12，P<0.05)，見(jiàn)圖4B。

2.4miR-188-5p過(guò)表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲 與miR-NC組相比，miR-188-5p組的miR-188-5p表達(dá)量顯著升高，增殖蛋白CyclinD1表達(dá)下降，增殖抑制蛋白p21表達(dá)明顯上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著下降，細(xì)胞增殖抑制率顯著上升，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(P<0.01，P<0.001)。見(jiàn)圖5，表3。

A：PRMT5的3′UTR中含有與miR-188-5p互補(bǔ)的核苷酸序列；B：PRMT5蛋白表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 miR-188-5p過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

2.5抑制PRMT5表達(dá)可抑制肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲 與si-NC組相比，si-PRMT5組的PRMT5蛋白表達(dá)顯著下降，增殖蛋白CyclinD1表達(dá)顯著下降，增殖抑制蛋白p21表達(dá)顯著上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著下降，細(xì)胞增殖抑制率顯著上升，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(均P<0.001)，見(jiàn)表4,圖6。

表4 抑制PRMT5表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響

圖6 PRMT5和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6抑制miR-188-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了槐角黃酮(10 mg/ml)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲的作用 與對(duì)照組相比，槐角黃酮(10 mg/ml)組的A549細(xì)胞PRMT5蛋白表達(dá)量顯著上升，增殖蛋白CyclinD1表達(dá)顯著下降，增殖抑制蛋白p21表達(dá)顯著上升，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著下降，細(xì)胞增殖抑制率顯著上升，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(均P<0.05)；與槐角黃酮組+anti-miR-NC組相比，槐角黃酮組+anti-miR-188-5p組的A549細(xì)胞PRMT5蛋白表達(dá)量顯著下降，增殖蛋白CyclinD1表達(dá)上升，增殖抑制蛋白p21表達(dá)降低，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著上升，細(xì)胞增殖抑制率顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著上升(均P<0.05)。見(jiàn)圖7，表5。

1～4：對(duì)照組、槐角黃酮組、槐角黃酮+anti-miR-NC組、槐角黃酮+anti-miR-188-5p組

表5 抑制miR-188-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了槐角黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和遷移侵襲的作用

3 討 論

肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因，75%的患者在確診時(shí)已發(fā)展為晚期(Ⅲ/Ⅳ期)，2014年英國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局報(bào)告稱，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性肺癌(Ⅳ期)患者1年生存率僅為15%～19%〔12〕。盡管肺癌的診斷和治療(手術(shù)、放療、化療和靶向治療)有很大進(jìn)步，但是晚期患者預(yù)后仍然很差〔11〕。中藥在治療肺癌中起著越來(lái)越重要的作用，通過(guò)提高患者免疫力，改善微循環(huán)，抑制腫瘤新生血管形成及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，達(dá)到控制和抑制腫瘤的作用，改善放化療的不良反應(yīng)，提高患者生存質(zhì)量〔13〕。但中藥對(duì)肺癌的分子抑制機(jī)制，尚不完全清楚。

槐角是豆科植物槐(Sophora japonica L)的果實(shí)，具有涼血止血的功效，槐角富含異黃酮類化合物，對(duì)骨質(zhì)疏松和癌癥等具有較好的預(yù)防和治療作用，其中的化合物包括染料木素、槐屬苷、染料木苷、槐屬雙苷、刺芒柄花素、刺芒柄花苷、大豆苷等，其中的染料木素在合適的濃度對(duì)肺癌A549和胃腺癌BGC-823細(xì)胞抑制率分別可達(dá)82%和91%〔14〕?；苯寝D(zhuǎn)化產(chǎn)物染料木素和異櫻黃素對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用〔15〕，槐角黃酮對(duì)胰腺癌也有顯著的抑制作用〔4〕。本研究發(fā)現(xiàn)，槐角黃酮可抑制肺癌細(xì)胞A549的侵襲、遷移和增殖，且呈顯著的劑量依賴性，又一次驗(yàn)證了槐角黃酮的抗腫瘤作用。

miR-188能產(chǎn)生miR-188-5p和miR-188-3p兩種miRNA，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Zhang等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-188-5p在轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-188-5p可通過(guò)抑制LAPTM4B抑制磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。Wang等〔17〕最新發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織和細(xì)胞中，miR-188-5p表達(dá)異常升高，miR-188-5p通過(guò)上調(diào)癌基因婆羅雙樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子(SALL)4，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)抑制抑癌基因PTEN(第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，槐角黃酮可促進(jìn)A549中miR-188-5p的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-188-5p可以抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與Zhang等〔16〕研究結(jié)果類似；抑制miR-188-5p可逆轉(zhuǎn)槐角黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，說(shuō)明miR-188-5p在槐角黃酮的抑癌機(jī)制中發(fā)揮作用。

此外，本研究通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRMT5的3′-UTR序列中含有與miR-188-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，預(yù)示miR-188-5p與PRMT5之間可能存在結(jié)合位點(diǎn)或者調(diào)控關(guān)系。PRMT5可能參與槐角黃酮對(duì)肺癌A549的抑制機(jī)制。PRMT5是蛋白-精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，它形成獨(dú)特的同質(zhì)寡聚體，主要位于細(xì)胞質(zhì)，催化蛋白中精氨酸殘基對(duì)稱二甲基化的形成，與維持干細(xì)胞干性有關(guān)，腫瘤干細(xì)胞的出現(xiàn)有助于耐藥性的形成〔18〕。PRMT5通過(guò)調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞來(lái)決定其對(duì)化療藥物的敏感性〔19〕，同時(shí)其也是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的藥物治療靶點(diǎn)〔20〕。Sheng等〔21〕發(fā)現(xiàn)，PRMT5在肺癌和前列腺癌中通過(guò)調(diào)控編碼生長(zhǎng)和抗生長(zhǎng)因子的一組特定基因的表達(dá)，包括受體酪氨酸激酶和抗增殖蛋白，進(jìn)而調(diào)控癌細(xì)胞的增殖。Jing等〔22〕總結(jié)大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT5作為潛在的致癌基因，通過(guò)組蛋白和其他蛋白甲基化參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移和凋亡，對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，其高表達(dá)通常提示肺癌臨床預(yù)后較差。Jing等〔23〕研究表明，PRMT5 在人肺癌組織中經(jīng)常高表達(dá)，其通過(guò)組蛋白H4R3的對(duì)稱二甲基化抑制miR-99家族的轉(zhuǎn)錄，從而增加FGFR3的表達(dá)，進(jìn)而激活Erk1/2和Akt，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，敲除PRMT5可通過(guò)阻斷miR-99家族的組織學(xué)修飾抑制肺癌轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致。說(shuō)明槐角黃酮通過(guò)抑制PRMT5表達(dá)抑制肺癌。

此外，本研究證實(shí)在肺癌A549細(xì)胞中miR-188-5p和PRMT5之間具有調(diào)控關(guān)系，也說(shuō)明槐角黃酮通過(guò)miR-188-5p靶向抑制PRMT5進(jìn)而抑制肺癌。