丁苯酞對急性腦梗死大鼠血液流變學及血清同型半胱氨酸水平的影響

閆欣 江濤 李娜 唐彥

(河北省保定市第二中心醫(yī)院，河北保定 072750)

急性腦梗死(ACI)是一種臨床常見的腦血管疾病[1]，提高腦梗死的治愈率將是人們面臨的主要任務(wù)。大量研究表明，在腦缺血和缺氧后24h 內(nèi)，大量血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和其他神經(jīng)營養(yǎng)因子(NF)發(fā)生應(yīng)激增殖，并在缺血性半影區(qū)中開始產(chǎn)生大量內(nèi)皮細胞，并擴展到梗塞區(qū)域[2,3]。而血液粘度增加和紅細胞聚集是溶栓和患者死亡后第二次血栓形成的主要原因[4]。因此，有效降低血液粘度并減少炎癥反應(yīng)以改善高凝狀態(tài)具有重要意義，可降低溶栓后再出血風險。

丁苯酞（DL-3-正丁基酞，NBP）是首先在我國上市的一類新藥[5]，對急性缺血性中風具有治療作用[6]。NBP 可抑制神經(jīng)細胞凋亡，并保護神經(jīng)細胞免受由缺血和缺氧引起的損傷，神經(jīng)功能缺損、腦缺血和記憶損害[7]。超敏C 反應(yīng)蛋白(hs-CRP)是中風等腦部疾病的危險因素之一。為進一步研究NBP 在腦梗死治療中的價值，著重分析了NBP 對血液流變學、血清同型半胱氨酸水平和hs-CRP 及血管內(nèi)皮因子這些指標的影響，以及NBP 對神經(jīng)細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其機制，以期為ACI 有效治療方案提供理論參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立和處理分組

實驗動物為雄性Sprague-Dawley 大鼠（8 周齡，250～300g），購于中國科學院上海醫(yī)學研究院，將其喂養(yǎng)在籠子里，在晝夜節(jié)律的室溫下喂食。將大鼠分為(CK,n=10)、ACI 組(ACI,n=10)和藥物組(ACI+NBP,n=10)，三組均接受相同的飲食。在實驗結(jié)束時用戊巴比妥鈉(70mg/kg)處死。所有動物程序均按照動物研究指南進行，并由醫(yī)院委員會審查并批準。

1.2 血漿Hcy 的檢測及檢測設(shè)備

經(jīng)過1 夜禁食后，空腹收集大鼠血液樣本。將樣品儲存在-80℃用于后續(xù)實驗。血漿樣本通過高壓液相色譜法檢測Hcy 的濃度，參考Ozdem 等[8]方法。儀器設(shè)備：K2025 高效液相色譜儀（濟南海能儀器股份有限公司）。

1.3 ELISA 法檢測大鼠血清中VEGF 和hs-CRP 的水平

將100μL 樣品稀釋液和血清添加到每個孔中，然后在37℃的恒溫箱中保溫1.5h。隨后，將100μL 生物素標記的抗體工作溶液添加到每個孔中，在37℃下孵育1h。之后，將100μL 的抗生物素蛋白-HRP 標記的工作溶液添加到每個孔中，在37℃下孵育30min。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; Gibco,Grand Island,NY,USA)洗滌3次后，將TMB（3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）底物溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)洗滌加入以終止反應(yīng)，使用酶標儀測量吸光度。最后，根據(jù)計算公式計算VEGF 和hs-CRP 的水平。

1.4 TUNEL 法檢測大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡

將腦組織切片用4%多聚甲醛固定，用PBS 洗滌3 次，并逐滴添加50μL TdT 酶反應(yīng)溶液。隨后滴加50μL 鏈霉親和素-TRITC 標記溶液，在黑暗中孵育30min。用PBS 洗滌3 次后，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)保留細胞核，然后在室溫下孵育15min。最后，在顯微鏡下觀察染色。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

均采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。首先進行方差的均一性，然后進行t檢驗以比較兩組之間的差異。單向方差分析用于比較不同組之間的差異，然后進行事后檢驗（最低顯著性差異）。P＜0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NBP 對ACI 大鼠腦神經(jīng)元凋亡的影響

通過TUNEL 染色法檢測了ACI 大鼠腦神經(jīng)元凋亡，結(jié)果表明，與對照相比，ACI 大鼠神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)目顯著增加（圖1），而使用NBP 處理后神經(jīng)細胞凋亡的情況得到了緩解，基本恢復到CK組水平。

2.2 大鼠中紅細胞壓積和血沉的變化

對大鼠紅細胞壓積和血沉進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK 組相比，ACI 大鼠紅細胞壓積由37.4%顯著增加至42.7%，而使用NBP 后紅細胞壓積恢復到37.9%，接近CK 組 狀態(tài)（圖2A，P＜0.01）。在血沉檢測結(jié)果中，ACI 大鼠血沉由15.52mm/h 增加到18.86mm/h（圖2B），且在NBP 處理后顯著降低至16.18mm/h（P＜0.01）。

圖1 NBP 對ACI 大鼠腦神經(jīng)元凋亡的影響

圖2 ACI 大鼠中紅細胞壓積（A）和血沉（B）的變化情況

2.3 血漿黏度和纖維蛋白原含量水平的變化

對大鼠血漿粘度檢測結(jié)果如圖3A，ACI 大鼠中血漿粘度和假手術(shù)組（CK）對照相比有顯著的升高，并在NBP 處理后恢復初始水平（P＜0.01）。相似的，ACI 大鼠中纖維蛋白原也由較低水平的2.98mg/L 顯著增加至3.66mg/L，而在ACI+NBP 組則顯著降至2.68mg/L（圖3B，P＜0.01）。這些結(jié)果說明，NBP能夠顯著改善ACI 大鼠血液流變學指標，從而對大鼠起到保護作用。

圖3 ACI大鼠中血漿黏度（A）和纖維蛋白原含量水平（B）的變化情況

2.4 血清同型半胱氨酸水平的變化

同型半胱氨酸（Hcy）是評價ACI 的重要指標，利用高效液相色譜儀檢測了不同分組大鼠血清Hcy水平，結(jié)果如圖4 所示。與CK 組相比，ACI 大鼠血清中Hcy 含量顯著提高約1.6 倍（P＜0.01），而ACI+NBP 組大鼠中則與對照差異不顯著（P＞0.05）。說明NBP 能有效減少ACI 大鼠Hcy 水平，有效保護ACI 大鼠。

圖4 ACI 大鼠中血清同型半胱氨酸水平的變化情況

2.5 血管內(nèi)皮因子和超敏感C 反應(yīng)蛋白水平的變化

為了進一步驗證實驗結(jié)果可靠性，還對大鼠血管內(nèi)皮因子(VEGF)和hs-CRP 水平進行了檢測。結(jié)果：ACI 大鼠VEGF 含量較對照組顯著增加約1.2倍（P＜0.01），而ACI+NBP 組大鼠VEGF 則與CK組無顯著差異（圖5A）。同樣，hs-CRP 檢測結(jié)果與VEGF 結(jié)果類似，NBP 的處理顯著降低其在ACI大鼠中的高表達（圖5B，P＜0.01），從而有效緩解了ACI 的癥狀。

圖5 ACI 大鼠VEGF（A）含量和hs-CRP（B）水平的變化

3 討論

我國是腦血管疾病高發(fā)國家[9]，缺血性腦血管疾病的發(fā)病率占腦血管疾病的70%～80%，且腦梗死死亡率和致殘率相對較高[10]。因此，疾病嚴重程度的早期評估、及時的針對性治療已成為腦梗死研究重點[11]。

He 等[12]指出，DL-NBP 對創(chuàng)傷性脊髓損傷具有神經(jīng)保護和抗炎作用。體內(nèi)外實驗均證明DLNBP 可以顯著增強小膠質(zhì)細胞的活化和炎性因子的釋放，提高脊髓損傷的運動能力，并減少大鼠模型腔內(nèi)脊髓損傷的面積。Zhao 等[13]發(fā)現(xiàn)DL-NBP 對腦外傷具有良好的治療作用，同時實驗證明，用DL-NBP 治療后損傷周圍區(qū)域的凋亡因子水平顯著降低。實驗也發(fā)現(xiàn)用NBP 處理后ACI 大鼠中神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)目顯著減少，說明其對神經(jīng)元細胞凋亡具有有效地抑制作用，從而保護腦組織細胞免受損傷。研究結(jié)果還顯示，用NBP 治療后的ACI 大鼠中紅細胞壓積、血沉、血漿黏度和纖維蛋白原均顯著低于對照組，由此表明NBP 具有促進纖維蛋白溶解的作用及能有效改善ACI 大鼠的血液流變學性質(zhì)。以對ACI 大鼠起到保護作用。

Hcy 是在蛋氨酸代謝過程中形成的一種含硫非蛋白質(zhì)氨基酸[14]，是動脈粥樣硬化等血管疾病發(fā)病的危險因子之一。已證實Hcy 與許多疾病密切相關(guān)[15]。總血漿Hcy 升高被稱為高同型半胱氨酸血癥（HHcy）。研究證明HHcy 可減輕內(nèi)皮功能障礙，促進毒性半胱氨酸加合物代謝并維持氧化應(yīng)激[16]。

hs-CRP是腦梗死患者炎癥反應(yīng)重要指標之一，hs-CRP 水平的提高能夠有效指示炎癥反應(yīng)的嚴重程度，是腦梗死患者預(yù)后不良的高危因素之一[17,18]報道，hs-CRP 的增加對動脈粥樣硬化斑塊進展與脫落具有顯著促進作用[19]。而血管內(nèi)皮因子(VEGF)主要作用是調(diào)節(jié)機體血管滲透性，在機體腦組織缺氧情況下，活化巨噬細胞和單核細胞以及星形膠質(zhì)細胞，能夠分泌VEGF，從而加重患者缺血腦組織水腫[20]。實驗經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，NBP 能夠有效的降低大鼠因ACI 引起的VEGF 和hs-CRP 水平急劇增加的情況，抑制了其顯著的增加，從而有效的緩解腦梗死大鼠炎癥和血管內(nèi)皮功能。給予ACI 大鼠NBP治療有助于神經(jīng)功能修復，抑制神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，改善ACI 大鼠血液流變學和同型半胱氨酸水平，以及影響血管內(nèi)皮功能和超敏C 反應(yīng)蛋白水平，從而改善ACI 大鼠的生存質(zhì)量。