酶法測(cè)定糖化白蛋白試劑盒質(zhì)量控制指標(biāo)分析

郭世富 畢春雷

(1.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理中心、中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.北京市醫(yī)療器械檢測(cè)所，北京 101111)

糖化白蛋白(glycated albumin,GA)是葡萄糖通過非酶促糖基化反應(yīng)與血漿中白蛋白結(jié)合形成的酮胺類化合物，是臨床上血糖監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一，能反映近期血糖（2～3 周）情況，適用于血糖波動(dòng)較大的新發(fā)糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）患者治療效果評(píng)價(jià)、餐后高血糖癥，且GA 與糖尿病血管并發(fā)癥相關(guān)，可預(yù)測(cè)心血管事件的發(fā)生，具有較高臨床價(jià)值。而糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin,HbA)可反映檢測(cè)前2～3 個(gè)月內(nèi)的平均血糖水平，作為臨床監(jiān)測(cè)長(zhǎng)期血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)。與HbA相比，糖化白蛋白反映血糖短期波動(dòng)，避免因血紅蛋白變異而影響檢測(cè)結(jié)果，作為血糖檢測(cè)與控制的重要指標(biāo)，在臨床上越來越受到重視[1-5]。

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室使用的糖化白蛋白測(cè)定試劑盒大部分是采用酶法在自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行GA 定量，利用對(duì)白蛋白特異性更高的溴甲酚紫(bromocresol purple,BCP)替代原來的溴甲酚綠(bromocresol green,BCG)，對(duì)白蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，以減少球蛋白對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。通過糖化白蛋白與白蛋白比值的百分?jǐn)?shù)報(bào)告，作為臨床診斷的依據(jù)。已批準(zhǔn)上市的酶法測(cè)定糖化白蛋白試劑盒五十余種，由于沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制指標(biāo)，造成上市產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，同時(shí)造成不同檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性，不利于上市后產(chǎn)品質(zhì)量控制和監(jiān)督及糖化白蛋白指標(biāo)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究。該研究主要對(duì)糖化白蛋白質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估分析[6-8]。

1 儀器與試劑

HITACHI7020 自動(dòng)生化分析儀，上市中三個(gè)廠家GA 酶法檢測(cè)試劑盒。在自動(dòng)生化分析儀上設(shè)置檢測(cè)程序，由儀器自動(dòng)完成檢測(cè)。每次測(cè)定同時(shí)用質(zhì)控品予以監(jiān)控[9]。

2 測(cè)定原理

首先利用前處理液修飾血清白蛋白的-SH 基，與BCP 作用生成青紫色結(jié)合體，測(cè)定其吸光度(A)值得出白蛋白濃度。再利用特異性蛋白酶將GA水解為糖化氨基酸，后者被特異性的酮胺氧化酶(KAOD)生成過氧化氫，利用過氧化物酶指示系統(tǒng)生成色素，測(cè)定此色素的A 值，得GA 含量。

3 方法與結(jié)果

門診收集正常和異常人群的血清樣本40 例，冷凍，復(fù)融。HITACHI7020 自動(dòng)生化分析儀，按廠家說明書，先校準(zhǔn)，質(zhì)控品符合要求。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）》質(zhì)量控制指標(biāo)項(xiàng)目，建立糖化白蛋白質(zhì)量控制指標(biāo)，對(duì)相關(guān)項(xiàng)目進(jìn)行測(cè)試[10]。

3.1 空白吸光度

空白樣本應(yīng)不含被測(cè)物，但其基質(zhì)應(yīng)與待測(cè)常規(guī)樣本相同。如果空白樣本難獲得，可選用相應(yīng)基質(zhì)的樣本，但應(yīng)注意將基質(zhì)效應(yīng)減至最少。用三家試劑盒測(cè)試空白樣本，測(cè)得規(guī)定讀數(shù)點(diǎn)主波長(zhǎng)下的吸光度值(A)，見表1。

3.2 分析靈敏度

在糖化白蛋白樣本濃度為15g/L 時(shí)，測(cè)其吸光度變化的范圍。三家A、B、C 測(cè)得GA 的吸光度變化分別為0.094253，0.070898，0.069464。

3.3 線性

線性是指給出的測(cè)量結(jié)果與樣品中被測(cè)量的值直接成比例的能力。將高濃度GA 樣本、低濃度GA 樣本和生理鹽水以幾種比例進(jìn)行溶解而得到測(cè)試樣本，對(duì)各種濃度梯度的樣本的GA 濃度和ALB濃度進(jìn)行測(cè)定，各測(cè)定3 次，計(jì)算均值。測(cè)定三家試劑盒GA 線性參考物質(zhì)的測(cè)定值與標(biāo)稱值的回歸值之間的偏離程度。GA 檢測(cè)值與理論值進(jìn)行線性回歸分析見圖1、圖2、圖3。

表1 三個(gè)廠家試劑盒空白吸光度分析結(jié)果

圖1 廠家一試劑盒GA 線性擬合曲線

GA1 y=20.5997+1137.5325x，R2=0.998。

圖2 廠家二試劑盒GA 線性擬合曲線

GA2 y=0.0407+3.2978x，R2=0.998。

圖3 廠家三試劑盒GA 線性擬合曲線

GA3 y=-0.4546+36.2066x，R2=0.9996。

3.4 重復(fù)性

重復(fù)性反映在一組測(cè)量條件下的測(cè)量精密度。用試劑盒測(cè)試已知濃度的樣品，反復(fù)測(cè)定10 次，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差S，及變異系數(shù)CV。計(jì)算的結(jié)果均在2.0%之內(nèi)，具體結(jié)果見表2。

3.5 準(zhǔn)確性

準(zhǔn)確性反映測(cè)得量值與被測(cè)量的真值的一致程度。由于目前缺乏糖化白蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，采用不同廠家的產(chǎn)品進(jìn)行比對(duì)（B 與C），對(duì)糖化白蛋白進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)分析，分析測(cè)定結(jié)果差異。準(zhǔn)確性分析結(jié)果如圖4 所示。

圖4 廠家2 與廠家3 試劑盒的比對(duì)結(jié)果

線性回歸方程為：y=0.0273+0.9789x，r=0.9998。

由分析結(jié)果可以看出，C 和B 的糖化白蛋白結(jié)果更加相近，二者的相關(guān)系數(shù)大于0.975，回歸直線斜率在[0.9,1.1]內(nèi)，最大偏差不大于0.8g/L，說明二者的參照系統(tǒng)有相關(guān)性。

4 討論

糖化白蛋白能反映短期血糖變化的情況，因此可在早期發(fā)現(xiàn)糖尿病，評(píng)價(jià)降糖藥物療效，預(yù)測(cè)糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)以及監(jiān)測(cè)造血系統(tǒng)疾病患者的血糖控制方面具有重要的臨床診斷價(jià)值。針對(duì)酶法糖化白蛋白測(cè)定試劑盒建立統(tǒng)一的行業(yè)控制指標(biāo)，保證產(chǎn)品的統(tǒng)一和質(zhì)量可控，使試驗(yàn)結(jié)果具有可比性，促進(jìn)臨床應(yīng)用研究。

表2 三個(gè)廠家試劑盒的重復(fù)性分析結(jié)果

針對(duì)糖化白蛋白診斷試劑盒建立了空白吸光度、分析靈敏度、線性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性的質(zhì)量控制指標(biāo)，此質(zhì)量控制指標(biāo)的建立為此類試劑產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一奠定了良好的基礎(chǔ)。針對(duì)上市的三家試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行試驗(yàn)分析結(jié)果表明，酶法糖化白蛋白試劑均具有較好的空白吸光度、分析靈敏度、線性及重復(fù)性。同時(shí)，由于不同廠家采用各自的標(biāo)定系統(tǒng)，采用不同的生產(chǎn)工藝和原材料，缺乏統(tǒng)一國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和溯源體系，因此比對(duì)結(jié)果存在一定的差異。但由于準(zhǔn)確性是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)非常重要的性能指標(biāo)，建議規(guī)范偏差極限范圍，以鼓勵(lì)企業(yè)通過技術(shù)完善，提高產(chǎn)品控制質(zhì)量。同時(shí)建議加強(qiáng)糖化白蛋白國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的研發(fā)，建立起國(guó)內(nèi)糖化白蛋白產(chǎn)品的溯源體系，保證各生產(chǎn)企業(yè)之間的統(tǒng)一性，促進(jìn)行業(yè)的規(guī)范和發(fā)展，同時(shí)為臨床使用者帶來方便。