呼吸病區(qū)碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的分子流行病學(xué)分析

姚欣，黎彧利

(重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 401320)

鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染的常見(jiàn)病原菌，常引起包括肺炎、敗血癥、尿路感染，傷口感染等多種醫(yī)院內(nèi)的感染。隨著抗生素的廣泛使用，眾多文獻(xiàn)報(bào)道耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來(lái)挑戰(zhàn)[1]。往往分離到耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌的患者病情都較重，或在醫(yī)院內(nèi)住院時(shí)間較長(zhǎng)，其分泌物、排泄物等可能成為污染源，如果醫(yī)護(hù)人員和病房消毒不徹底，極有可能通過(guò)醫(yī)護(hù)人員的手、醫(yī)療器械、圍簾等在院內(nèi)傳播[2]。該研究通過(guò)對(duì)呼吸病區(qū)病人標(biāo)本、醫(yī)護(hù)人員手和護(hù)理單元圍簾分離到的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子分型，研究其相關(guān)性和傳播途徑，為防止耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌在院內(nèi)傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

鮑曼不動(dòng)桿菌分離自2017年7月—12月非重復(fù)株(同一患者只留取初次分離株)，全部菌株使用BDphoenix100全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀進(jìn)行菌種鑒定。

質(zhì)控菌株于2017年購(gòu)于溫州康泰生物科技有限公司，此次實(shí)驗(yàn)用到的質(zhì)控菌株包括ATCC25922、ATCC27853。

1.2 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

使用BDphoenix100全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀，MIC法測(cè)定10種抗菌藥物的敏感性。根據(jù)美國(guó)CLSI2017年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏判讀，把其中分離于呼吸病區(qū)分離的碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌作為本研究的實(shí)驗(yàn)菌株。

1.3 隨機(jī)引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型

DNA制備：收集純培養(yǎng)菌落于Ep離心管，加入200ng/mL蛋白酶K200μL，充分混勻后37℃4小時(shí)，加入Chelex-100 40mL，15000r/min離心30s，取上清液作為擴(kuò)增模版液。RAPD擴(kuò)增總體積為25μL，包括4種dNTPs各200μmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，DNA模版0.5ng/μL，隨機(jī)引物(序列5'-TTATGTAAAACGACGGCCAGT-3')1.25μmol/L。PCR條件：94℃變性4min，94℃變性45s，36℃復(fù)性45s，72℃延伸2min，共40個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL以1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外凝膠電泳儀觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.4 耐藥基因檢測(cè)

用PCR方法檢測(cè)blaTEM、blaVIM、IMP-1、IMP-2、OXA-23、OXA-24、Int1、Int2酶的編碼基因，各基因的擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 23株碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗菌藥物藥敏情況

23株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、亞胺培南、美羅培南，除阿米卡星和黏菌素外其他抗菌藥物耐藥率均較高，12種抗菌藥物藥敏情況見(jiàn)表2。

2.2 隨機(jī)引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型結(jié)果

隨機(jī)引物多態(tài)性DNA(RAPD)分型表明23株鮑曼不動(dòng)桿菌中有1株細(xì)菌(5號(hào)菌株，圖1)不是同一克隆，其余細(xì)菌均來(lái)源于同一克隆株。17株病人標(biāo)本來(lái)源鮑曼不動(dòng)桿菌分布在呼吸科不同病房，經(jīng)醫(yī)院感染科2017年7—12月采樣，醫(yī)護(hù)人員手和病房圍簾分別檢出1株和3株鮑曼不動(dòng)桿菌，且與18株病人標(biāo)本檢出鮑曼不動(dòng)桿菌有同源性，從而推斷呼吸科碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的爆發(fā)與醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生和圍簾均有相關(guān)性。

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

表1 靶基因PCR引物序列

23株鮑曼不動(dòng)桿菌中blaTEM、OXA-23、整合酶Int1的陽(yáng)性率分別為95.7%、69.5%及82.6%，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起肺炎、重癥病人感染的重要病原菌，也是醫(yī)院感染的常見(jiàn)病原菌，醫(yī)院病人標(biāo)本分離株常呈多重耐藥，且碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌越來(lái)越多見(jiàn)[3]。耐藥菌可以在特定的環(huán)境中引起傳播和流行，以致感染的發(fā)病率和病死率日益增加[4]。

碳青霉烯類抗生素是目前臨床抗菌活性最強(qiáng)大的抗生素之一。隨著該藥的廣泛使用，已出現(xiàn)碳青霉烯類耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，導(dǎo)致感染流行成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。本研究分析23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥情況表明：氨芐西林、哌拉西林、頭孢唑林、氯霉素、氨曲南、頭孢他啶、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、美羅培南12種抗生素耐藥率為100%，氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、復(fù)方磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、亞胺培南耐藥率＞90%，阿米卡星耐藥率也高達(dá)76.3%，僅有黏菌素敏感率為100%。黏菌素作為近年來(lái)的新型抗生素還保持著對(duì)碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的治療活性，作為治療碳青霉烯耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的最后防線。

表2 23株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物敏感性

圖1 RAPD結(jié)果顯示5號(hào)與其他不同

表3 23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌隨機(jī)引物多態(tài)性對(duì)其同源性分析發(fā)現(xiàn)：除一株來(lái)源于患者痰培養(yǎng)分離株外，其余22株為同一克隆株，其中有1株來(lái)源于醫(yī)護(hù)人員手，3株來(lái)源于病房圍簾，這表明碳?xì)涿瓜╊惸退庻U曼不動(dòng)桿菌在2017年7月—12月期間在我院呼吸科流行，很有可能與醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生以及病房環(huán)境相關(guān)，不排除還存在其他病房環(huán)境因素的風(fēng)險(xiǎn)可能。

文獻(xiàn)報(bào)道，鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生不同類型的β-內(nèi)酰胺酶成為β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因，國(guó)內(nèi)從多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)了多種β-內(nèi)酰胺酶，最主要是質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)胺酶(ESBLs)。本研究從23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)blaTEM、blaVIM，結(jié)果blaTEM陽(yáng)性率高達(dá)95.7%，鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)胺酶合并外膜蛋白缺失、PBPs改變或主動(dòng)外排機(jī)制，可能是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥嚴(yán)重的原因。

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制最主要是產(chǎn)生碳青霉烯酶。不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要為B類金屬酶和D類苯唑西林酶。B類金屬酶，常見(jiàn)有blaIMP和blaVIM型β-內(nèi)酰胺酶；D類苯唑西林酶為OXA類酶。本研究23株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌金屬酶IMP-1陽(yáng)性率為26.1%(6/23)，OXA-23陽(yáng)性率為69.5%(16/23)。可以看出我院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥主要機(jī)制也是產(chǎn)D類苯唑西林酶，OXA-23可存在于質(zhì)?；蛉旧w上，通過(guò)可移動(dòng)元件如轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒在不同菌株、不同個(gè)體之間傳播[5-6]，與國(guó)內(nèi)報(bào)道流行基因型為OXA-23一致[7]。

整合子是一個(gè)新的細(xì)菌耐藥基因水平傳播單元，是細(xì)菌獲得性耐藥的重要途徑，它是存在于質(zhì)粒和(或)染色體上的具有基因捕獲和表達(dá)功能的遺傳單位，介導(dǎo)耐藥基因水平傳播和轉(zhuǎn)移[8]。研究報(bào)道，整合子陽(yáng)性的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的總體耐藥率高達(dá)90%左右，而整合子陰性鮑曼不動(dòng)桿菌的總體耐藥率僅為60%[9]。IntI1、IntI2、IntI3類整合酶是多重耐藥整合子。本研究中整合酶Int1陽(yáng)性率高達(dá)82.6%(19/23)，說(shuō)明我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要以I類整合子為主。

本研究顯示，我院碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要攜帶TEM廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因、產(chǎn)IMP-1金屬酶和OXA-23型碳青霉烯酶、I類整合子，產(chǎn)生OXA-23型碳青霉烯酶是主要耐藥機(jī)制。同期檢出的鮑曼不動(dòng)桿菌有1株來(lái)源于醫(yī)護(hù)人員手，3株來(lái)源于病房圍簾，說(shuō)明環(huán)境因素很可能與病人間鮑曼不動(dòng)桿菌的流行相關(guān)[10]。有研究報(bào)道多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在環(huán)境、醫(yī)務(wù)人員和患者之間傳播，我國(guó)也有發(fā)現(xiàn)同一克隆株的感染暴發(fā)[12-13]。有研究認(rèn)為，優(yōu)勢(shì)克隆株在醫(yī)院的持續(xù)存在可能與該地區(qū)抗生素壓力有關(guān)，全基因組和比較基因組發(fā)現(xiàn)，即使屬于同一克隆，其質(zhì)粒、耐藥島等基因結(jié)構(gòu)也呈多變性，可能與不同壓力環(huán)境下活躍的基因組有關(guān)[15]。所以持續(xù)對(duì)同一地區(qū)的同一克隆株進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有助于了解其變化趨勢(shì)。

4 結(jié)論

加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生是遏制醫(yī)院感染蔓延的有效途徑，特別是檢出多重耐藥菌感染或攜帶的患者床旁必須放置手消毒劑，加強(qiáng)手依從性監(jiān)督[11,14]。病房圍簾應(yīng)定期清洗消毒后使用，同時(shí)提示病房床單、窗簾、床欄以及呼吸機(jī)、監(jiān)護(hù)儀等的清潔消毒與監(jiān)測(cè)都要定期完成，盡量減少醫(yī)院感染的發(fā)生，減少院內(nèi)微生物傳播的風(fēng)險(xiǎn)，特別是呼吸病區(qū)、重癥監(jiān)護(hù)室等易感區(qū)域。