ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗與IBD 活疫苗免疫商品蛋雞的效果比較

屈貴蜀，黃瑞玲，星 東，彭瑤順，莊許諾，許麗惠，江興華，王全溪

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福建 福州 350002；2.福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，造就了越來(lái)越密集的養(yǎng)殖條件，傳染病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也隨之被加大。近幾年傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease, IBD）與新城疫（Newcastle disease，ND）這兩種病在養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)中經(jīng)常發(fā)生，并且給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。通過(guò)對(duì)兩種疫苗的免疫效果比較可以為二者的安全合理使用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，預(yù)防該兩種傳染病的方法依然是疫苗接種，對(duì)于該病的預(yù)防，一般采用常規(guī)疫苗進(jìn)行免疫接種，但也有一些是通過(guò)改進(jìn)后的特定的疫苗進(jìn)行免疫[3-4]。弱毒活苗容易被母源抗體中和，引起免疫失敗。雖然中強(qiáng)毒力及中等偏強(qiáng)毒力的IBD 與ND 活苗可以突破母源抗體的干擾，但會(huì)對(duì)雛雞法氏囊造成損傷，引起法氏囊萎縮導(dǎo)致免疫抑制[5]。疫苗免疫使機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞免疫，T 淋巴細(xì)胞被激活引起免疫器官中細(xì)胞因子水平的變化；CD4 和CD8 T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，可以作為體內(nèi)免疫狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)。陸吉虎等[6]研究表明疫苗會(huì)有效提高機(jī)體內(nèi)免疫因子T 細(xì)胞CD4+、CD8+T、IL-4 等分泌。白細(xì)胞介素（Inter leukin, IL）是免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子。IL-6 在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面具有重要影響意義[7]，它能促進(jìn)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞增殖、分化并產(chǎn)生抗體?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】活苗免疫存在諸多安全問(wèn)題，研究發(fā)現(xiàn)有些活苗免疫會(huì)因免疫個(gè)體抗體水平不一致導(dǎo)致毒株變異，嚴(yán)重的情況下會(huì)引起疫病爆發(fā)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。滅活疫苗對(duì)IBD 與ND 具有很好的免疫效果，且安全性高。ND-IBD 二聯(lián)滅活苗在諸多方面進(jìn)行了改進(jìn)，它的改進(jìn)能避免常規(guī)活苗的缺陷。所以，比較ND-IBD 二聯(lián)滅活苗與IBD 活疫苗在商品蛋雛雞的免疫效果及機(jī)體對(duì)該疫苗的免疫反應(yīng)是一個(gè)值得研究的方向?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為比較分析ND-IBD 二聯(lián)滅活苗與IBD 活苗的免疫效果，將兩種疫苗分別對(duì)同日齡商品蛋雞進(jìn)行免疫，免疫后每周檢測(cè)IBD 抗體水平和免疫器官中基因CD4+、CD8+、IL-6 mRNA 表達(dá)量，且進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，為NDIBD 二聯(lián)滅活苗的免疫效果及其實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物：120 羽1 日齡商品蛋雞購(gòu)自福州某雞場(chǎng)，該雞場(chǎng)中種雞免疫水平NDV 和IBDV 均屬于正常抗體水平。經(jīng)檢測(cè)，1 日齡的NDV 抗體水平為（6.40±1.34）log2，且差異不顯著；IBDV 抗體水平為（12.30±0.46）log2，且差異不顯著。強(qiáng)毒株IBDV（BC6-85株）、ND-IBD 二聯(lián)滅活苗（LaSota+HQ 株）與IBD活苗，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供；IBDV抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清；PBS 液；96 孔v 型微量反應(yīng)板；Marker 購(gòu)自Thermo Scientific 公司；TransZol UP Plus RNA Kit 的RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GoScriptTMReverse 反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qPCR 所需的熒光試劑盒均購(gòu)自廈門(mén)泰京生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 選取體重、健康水平相近的1 日齡商品蛋雞120 只，分成A、B、C 三個(gè)處理組。A 組為對(duì)照組，B 組為IBD 活苗免疫組，C 組為ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗免疫組；A、B、C 組分別于雛雞7 日齡時(shí)進(jìn)行免疫，分別皮下注射0.3 mL 生理鹽水、0.3 mL IBD 活疫苗、0.3 mL ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗。試驗(yàn)期42 d，免疫后每7 d 采血并進(jìn)行血清的分離，采用中和試驗(yàn)檢測(cè)IBDV 抗體水平。

1.2.2 抗體檢測(cè) 在7 日齡時(shí)對(duì)之前已經(jīng)采血的30 只雞檢測(cè)免疫前抗體水平，用中和試驗(yàn)的方法檢測(cè)IBDV 抗體。各組于21、28、35、42 日齡也采血檢測(cè)IBDV 抗體水平。IBDV 微量中和試驗(yàn)抗體水平檢測(cè)方法，具體如下：（1）細(xì)胞維持液連續(xù)倍比稀釋血清（1∶2～1∶64），分別取50 μL 加入96 孔板中，每個(gè)稀釋度作4 孔。同時(shí)設(shè)置陰性血清和陽(yáng)性血清對(duì)照。（2）加入50 μL 做200 TCID50病毒稀釋病毒，置37 ℃溫箱作用1 h。（3）每孔加入100 μL DF1 細(xì)胞懸液，置5% CO237 ℃溫箱培養(yǎng)，自培養(yǎng)48 h 開(kāi)始逐日觀察記錄。（4）結(jié)果判定和計(jì)算：當(dāng)被檢血清孔出現(xiàn)100% CPE 為陰性，50%以上細(xì)胞出現(xiàn)保護(hù)者為陽(yáng)性，計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)。其中培養(yǎng)板采用96 孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，血清的稀釋采用固定抗原稀釋血清的β 微量法，抗原用200 個(gè)TCID50。另外在做中和試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意200 個(gè)TCID50的準(zhǔn)確配制、控制每孔加入細(xì)胞的量和抗體作用的時(shí)間。

1.2.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 在各組雞21、28、35、42 日齡時(shí)，對(duì)其進(jìn)行IBDV 攻毒保護(hù)試驗(yàn)，并在攻毒前對(duì)毒株進(jìn)行毒力試驗(yàn)。每只口服0.2 mL IBDV BC6-85 株（2×104BID50），觀察攻毒保護(hù)結(jié)果。操作步驟如下：

（1）將病毒原液分裝于5 個(gè)試管中進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5；（2）選用同一批條件一致的SPF 雞20 只，分成5 組，每組4 只，并在頭部做標(biāo)記。采用1 mL 注射器，每只雞注射0.2 mL；（3）感染SPF 雞72 h 后，剖檢法氏囊觀察病變情況并拍攝記錄，統(tǒng)計(jì)感染雞發(fā)病、死亡情況及半數(shù)致死量，并對(duì)攻毒保護(hù)率進(jìn)行計(jì)算[8]。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 在NCBI 上查找雞CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因核苷酸序列，采用Oligo7生物軟件設(shè)計(jì)4 對(duì)特異引物，然后由上海生工生物工程股份有限公司合成。5′到3′方向引物序列及大小參考文獻(xiàn)[9]。

1.2.5 組織RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 總RNA 提取：剖檢取脾臟與法氏囊組織，分別加液氮研磨破碎后放入裂解消化液中，冰上靜置后離心，取水相過(guò)柱，去除雜質(zhì)，最后用ddH2O 收集RNA。

反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[9]。CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法采用的是2－ΔΔCT法[10]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 17.0；序列比對(duì)分析軟件為DNAMAN；熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Express 3.0；實(shí)時(shí)熒光定量分析軟件為L(zhǎng)ight Cyclcr 480。

2 結(jié)果與分析

2.1 ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗與IBD 弱毒活苗對(duì)商品蛋雞IBDV 抗體的影響

由圖1 可知，在7～42 日齡，C 組IBDV 抗體水平均顯著高于B 組（P＜0.05），且在21～42 日齡，C 組IBD 抗體水平逐漸上升，顯著高于A 組與B 組（P＜0.05）；而隨著日齡的增加，A 組與B 組抗體水平均逐漸下降，說(shuō)明 ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗能夠更好、更快提升幼齡仔雞的抗體水平。

2.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

從表1 可知，21 日齡時(shí)和28 日齡時(shí)，C 組攻毒保護(hù)率均高于B 組與對(duì)照組；35 日齡及之后，A 組的攻毒保護(hù)率只有0，而C 組和B 組都是100%?？梢?jiàn)，C 組和B 組均能有效保護(hù)商品蛋雛雞免受IBDV 的感染。剖檢結(jié)果從圖2 可知，21 日齡和28 日齡時(shí)，A 組脾臟腫大，法氏囊腫大、出血，B 組法氏囊出血，C 組未見(jiàn)異常；而 35 日齡時(shí)，A 組脾臟腫大，法氏囊出血，其他組均正常。

圖1 兩種IBDV 疫苗對(duì)蛋雞抗體形成水平的影響Fig.1 IBDV antibody in chicks after immunized by two different vaccines

表1 不同疫苗免疫蛋雞的攻毒保護(hù)率Table 1 Survival rate of chicks after IBDV infection challenge test

圖2 IBDV 攻毒試驗(yàn)保護(hù)脾臟和法氏囊病變情況Fig.2 Lesion occurrences on spleen and bursal of chicks after IBDV infection challenge test

2.3 雞CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因熔解曲線的建立及分析

從圖3 可知，A 圖中CD4+基因熔解溫度控制在82～84 ℃時(shí)，B 圖中CD8+基因熔解溫度控制在83～85 ℃時(shí)，C 圖中IL-6 基因熔解溫度控制在83～85 ℃時(shí)，D 圖GAPDH 基因熔解溫度控制在83～85 ℃時(shí)，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物等雜峰出現(xiàn)[10]。表明CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因的引物均具有良好的特異性。

2.4 ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗與弱毒活苗對(duì)商品蛋雞法氏囊中CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 表達(dá)量的影響

從圖4 可知，法氏囊中C 組基因CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 表達(dá)量總體趨勢(shì)隨著雞日齡的增長(zhǎng)而升高，且表達(dá)量均高于B 組與A 組，所測(cè)日齡中，CD4+的表達(dá)量均是C 組與B 組顯著高于A 組，在21 日齡時(shí)C 組與B 組差異不顯著（P＞0.05），其他日齡C 組顯著高于B 組（P＜0.05）（圖4-A）；在21、28 日齡時(shí)，B 組CD8+基因的mRNA 表達(dá)量顯著高于A 組（P＜0.05），但與C 組差異不顯著，而在35、42 日齡時(shí)，C 組基因CD8+的mRNA 表達(dá)量顯著高于B 組（P＜0.05）（圖4-B）；在28、35、42 日齡時(shí)，C 組基因IL-6 的mRNA 表達(dá)量顯著高于B 組（圖4-C）?？梢?jiàn)，ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗和弱毒活苗均可以誘導(dǎo)法氏囊中CD4+、CD8+、IL-6 基因的表達(dá)，但是ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗比弱毒活苗具有誘導(dǎo)CD4+、CD8+、IL-6 基因更長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)的特點(diǎn)。

2.5 ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗與弱毒活苗對(duì)商品蛋雞脾臟中CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 表達(dá)量的影響

從圖5 可知，脾臟中所檢測(cè)的CD4+、CD8+、IL-6 基因的mRNA 表達(dá)量是：C 組隨著雞日齡的增長(zhǎng)而升高，除21 日齡外，均顯著高于B 組與A 組（P＜0.05）。42 日齡時(shí)，B 組CD4+表達(dá)量與A 組差異不顯著（P＞0.05），其他日齡差異顯著（P＜0.05） （圖5-A）。所有日齡中，C 組與B 組基因CD8+的mRNA 表達(dá)量比A 組顯著增加（P＜0.05）（圖5-B）；所有日齡中，C 組與B 組基因IL-6 的mRNA 表達(dá)量比A 組顯著增加（P＜0.05）（圖5-C）。可見(jiàn)，ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗和弱毒活苗均可以誘導(dǎo)脾臟中CD4+、CD8+、IL-6 基因的表達(dá)，但是ND-IBD 二聯(lián)滅活疫苗比弱毒活苗具有誘導(dǎo)CD4+、CD8+、IL-6 基因更長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)的特點(diǎn)。

圖3 CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因的熔解曲線Fig.3 Melting curves of CD4+, CD8+, IL-6, and GAPDH

圖4 各日齡雞的法氏囊組織中基因CD4+、CD8+、IL-6 表達(dá)量變化水平Fig.4 mRNA expressions of CD4+, CD8+, and IL-6 in infectious bursal tissue

3 討論

據(jù)研究報(bào)道，接種雞法氏囊炎弱毒活疫苗由于受母源抗體的干擾，致使免疫效果千差萬(wàn)別，有時(shí)甚至導(dǎo)致免疫失敗。中等毒力活疫苗雖能達(dá)到更好的免疫效果，但又會(huì)引起法氏囊組織損傷、毒力返強(qiáng)、殘留毒力導(dǎo)致的免疫抑制，以及參與新變異株基因重組等一系列生物安全問(wèn)題[11-12]?；蠲缑庖吆笤诋a(chǎn)生抗體時(shí)，也會(huì)引起機(jī)體免疫器官損傷[13]，如Rautenschlein 等[14]證實(shí)了帶有中等強(qiáng)度毒株的弱毒疫苗雖然可以克服母源性抗體的干擾對(duì)機(jī)體產(chǎn)生抗體，但是由于毒力足夠突破母源抗體而感染雛雞造成法氏囊損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致雛雞出現(xiàn)免疫抑制?？梢?jiàn)弱毒活苗易受母源抗體的影響，在免疫早期效果不理想。

圖5 各日齡雞的脾臟組織中基因CD4+、CD8+、IL-6 表達(dá)量變化水平Fig.5 The mRNA expression of CD4+、CD8+、IL-6 in spleen

預(yù)防ND 與IBD 需對(duì)雛雞多次免疫，易引起雛雞應(yīng)激反應(yīng)，造成經(jīng)濟(jì)損失。為了減少免疫次數(shù)過(guò)多而導(dǎo)致雞群的應(yīng)激反應(yīng)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)開(kāi)始對(duì)聯(lián)苗的研究投入大量的人力、物力[15]。研發(fā)的滅活疫苗具備安全性并保留良好的抗原性且無(wú)副作用。針對(duì)雞傳染性法氏囊病活苗免疫效果不理想的問(wèn)題，本試驗(yàn)選擇了具有高度濃縮抗原的ND-IBD 二聯(lián)滅活苗與市場(chǎng)常規(guī)IBD 活疫苗進(jìn)行比較分析二者免疫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有高度濃縮抗原的ND-IBD 二聯(lián)滅活苗表現(xiàn)出了抗體形成早、維持時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。

另外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)7 日齡雛雞進(jìn)行ND-IBD 二聯(lián)滅活苗免疫，攻毒保護(hù)效果理想。吳玲等[16]研究也表明IBD 活苗免疫越早受母源抗體干擾越大。有研究[17]表明，7 日齡處于母源抗體半衰期后，母源抗體對(duì)疫苗抗原影響小，免疫效果優(yōu)于1 日齡。一般預(yù)防接種IBD 與ND 疫苗均選用7 日齡免疫。

本研究發(fā)現(xiàn)，具有高度濃縮抗原的ND-IBD 二聯(lián)滅活苗能夠更好地保護(hù)免疫器官。章振華等[18]分別用雞傳染性法氏囊病免疫復(fù)合物疫苗和活疫苗免疫1 日齡SPF 雛雞，免疫后9 d 剖檢發(fā)現(xiàn)，免疫器官法氏囊萎縮情況存在明顯差異，免疫復(fù)合物疫苗組正常，而活疫苗組全部萎縮，免疫后21 d 和28 d，復(fù)合物疫苗免疫組的保護(hù)率均達(dá)到了100%。

淋巴細(xì)胞表面分子和細(xì)胞介素對(duì)于機(jī)體的免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)功能。本試驗(yàn)采用的二聯(lián)滅活苗也有效提高了脾臟和法氏囊的CD4+、CD8+和IL-6 基因的轉(zhuǎn)錄水平量。有研究[19]指出，使用雞白細(xì)胞介素-2 或雞白細(xì)胞介素-18 融合表達(dá)的IBDV VP2蛋白進(jìn)行免疫，其免疫原性會(huì)增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)[20]，CD4～+CD25～+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞具有免疫抑制作用。CD4～+CD25～+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞可由多種類(lèi)型腫瘤、病原體誘導(dǎo)產(chǎn)生。一方面抑制炎癥，另一方面有利于腫瘤和病原體逃避宿主免疫攻擊。鄭笑笑[21]分析了白細(xì)胞介素（IL-2、IL-6）、T 細(xì)胞亞群（CD4+/CD8+、CD4+、CD8+）水平與慢性丙型肝炎患者病情程度的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：血清IL-2、CD4+/CD8+、CD4+與慢性丙型肝炎病情呈負(fù)相關(guān)；血清IL-6、CD8+與慢性丙型肝炎病情呈正相關(guān)。錢(qián)文亞等[22]探討和分析CD4+T、CD8+T 細(xì)胞及白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、干擾素（IFN-γ）等水平的檢測(cè)在支原體肺炎中的臨床價(jià)值，并研究說(shuō)明了人體感染肺炎后體內(nèi)CD4+T、CD4+/CD8+細(xì)胞比值失衡，支原體肺炎經(jīng)有效治療后，外周血中CD4+T、CD8+T明顯增加，而IL-4、IL-6、IFN-γ 水平明顯下降。