基于高效液相指紋圖譜技術(shù)的五常大米產(chǎn)地鑒別研究

□ 李琳，錢麗麗，2 （.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 6339； 2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，大慶 6339）

引言

大米是最重要的主食之一，提供了世界50%人口的口糧[1]。中國是世界主要的大米種植地區(qū)，改革開放以來，隨著人們生活品質(zhì)的提高，人們不再僅僅滿足于溫飽，對大米品質(zhì)的要求也在提高。黑龍江素有“北大倉”之稱，是重要的大米產(chǎn)業(yè)基地，水稻種植面積占全國種植總面積的 12% 。黑龍江部分地區(qū)的大米因其優(yōu)良的品質(zhì)，深受消費者的歡迎，是被授予地理標(biāo)志產(chǎn)品最多的省份之一。其中最為出名的是五常大米，五常大米是生活中做米飯的佳品，其顆粒飽滿、質(zhì)地堅硬、色澤清白透飯粒油亮、香味濃郁，素有“貢米”之稱，然而，不法商販為追求利益，市場上假冒地理標(biāo)志大米屢見不鮮，損害企業(yè)和消費者的利益。

為了建立標(biāo)準(zhǔn)五常大米指紋圖譜，本試驗采用五常大米和非五常大米為實驗材料，先預(yù)處理五常大米樣品，參考文獻(xiàn)方法并略微改動測得大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜數(shù)據(jù)，分析所得數(shù)據(jù)，建立五常大米標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，最后用非五常大米驗證其可行性和準(zhǔn)確性。

主要內(nèi)容如下：

（1）查閱現(xiàn)今已有大米產(chǎn)地溯源的文獻(xiàn)，確定乙酸乙酯提取物的主要成分多為多酚類化合物[2-3]。

（2）根據(jù)文獻(xiàn)對大米進(jìn)行處理，第一次加乙酸乙酯是為了提取大米中游離的多酚類物質(zhì)，第二次是提取出結(jié)合的多酚類物質(zhì)。

（3）將處理后的樣品導(dǎo)入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析，得出數(shù)據(jù)。

（4）建立標(biāo)準(zhǔn)五常大米色譜指紋圖譜。

（5）最后用五常大米指紋圖譜作為參照，和非五常大米大米的指紋圖譜進(jìn)行相似度計算，確定該方法的可行性和準(zhǔn)確性。

1. 材料與方法

1.1 試驗材料

選取個不同產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)五常大米和非五常大米為樣本磨粉裝袋放入冰箱備用。本試驗樣品采于2019年9月，這時各主產(chǎn)村鎮(zhèn)水稻已經(jīng)完全成熟，每個樣品地點采集水稻5kg左右，然后記錄下各品種信息如表1。

表1 大米樣品信息表

1.2 試驗試劑

甲醇和乙酸乙酯為色譜純，鹽酸、乙酸為優(yōu)級純（天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）。

1.3 試驗儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（DAD），在線脫氣機(jī)及柱溫箱。CW-2000型超聲協(xié)同萃取儀（新拓微波溶樣檢測技術(shù)有限公司），低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）

1.4 實驗色譜條件

色譜柱：Universal C18，5μm，250mm×4.6mm；

流動相流速：1.0mL/min；

檢測波長：276nm；

參比波長：280nm；

柱溫：30 ℃；

進(jìn)樣量：20uL。

流動相：甲醇（A）和體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙酸溶液（B），梯度洗脫程序見表2。

表 2 色譜儀梯度洗脫程序

1.5 試驗方法

1.5.1 樣品預(yù)處理

將采集回來稻谷樣品晾曬至水分14%以下，參照國標(biāo)GB/T 1354-2009《大米》、GB/ 5502-2008《米類加工精度檢驗》在實驗室完成大米統(tǒng)一加工方式，進(jìn)行脫粒、礱谷、碾米獲得精米，并對精米旋風(fēng)磨處理，過100目尼龍篩，得到大米粉末樣本。所有樣本采用統(tǒng)一處理方式。

1.5.2 樣品分析

準(zhǔn)確稱取粉碎后大米（50目）60.00g，加入100mL乙酸乙酯，置于超聲波協(xié)同萃取儀中，30℃超聲波提取10min，分離出上層液體，在大米殘渣中加入6mol/L的鹽酸溶液3mL，同時加入100mL乙酸乙酯混勻，再提取，然后將兩次提取的液體在低速離心機(jī)中以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，最后將離心后的液體置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，47 ℃蒸干。準(zhǔn)確加入體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇2mL，混勻后，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾，濾液用于液相色譜分析，進(jìn)樣量為20mL。

1.5.3 樣品乙酸乙酯提取物制備

2 結(jié)果與分析

2.1 大米乙酸乙酯提取物液相色譜分析方法

將處理好的大米乙酸乙酯提取液重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄液相色譜指紋圖譜（見圖1）。結(jié)果表明，其中各主要色譜峰的保留時間和峰面積的相對偏差（RSD）分別為0.03-1.27%和1.31-4.52%，相似度大于0.99，符合指紋圖譜要求。

圖1 大米乙酸乙酯提取物液相色譜譜圖

2.2 大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜的構(gòu)建原則

大米指紋圖譜建立的是全面反映大米所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量，進(jìn)而反映大米的質(zhì)量，現(xiàn)在大米的有效成分絕大多數(shù)沒有明確，采用大米指紋圖譜的方式將有效地表征大米質(zhì)量。大米指紋圖譜的建立，應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究為依托，應(yīng)體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性、重現(xiàn)性三個基本原則。

“系統(tǒng)性”是指指紋圖譜所反映的化學(xué)成分應(yīng)包括大米有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部。乳銀杏葉的有效成分是黃酮類和銀杏內(nèi)酯類，則其指紋圖譜可采用兩種方法對這兩類成分，分別分析，以達(dá)到系統(tǒng)、全面的。

“特征性”是指指紋圖譜中反映的化學(xué)成分信息（具體表現(xiàn)為保留時間）是具有高度選擇性的，這些信息的綜合結(jié)果將能特征的區(qū)分大米的真?zhèn)危蔀榇竺鬃陨淼摹盎瘜W(xué)條碼”。

“重現(xiàn)性”是指所建立的指紋圖譜，在規(guī)定的方法和條件下，不同操作者和不同實驗室應(yīng)能作出相同的指紋圖譜，其誤差應(yīng)在允許的范圍內(nèi)，這樣才可以保證指紋圖譜具有通用性和實用性，也是作為標(biāo)準(zhǔn)方法所具備的特征之一。

2.3 大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜的建立

2.3.1 大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜

將8批次五常大米色譜圖截取到71min后的色譜峰，通過多點校正的方法（圖2），對8個樣品的色譜峰進(jìn)行匹配并自動生成對照圖譜，該指紋圖譜S是由63指紋峰和19個共有峰組成（見圖3和表3）。特征峰的選取原則是：主要特征峰和相鄰峰度要達(dá)到1.2以上，其他的特征峰也要有一定的分離，峰尖到峰谷的距離最少大于該峰高度的2/3以上。通過表可以得出，19個供應(yīng)峰的保留時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.01-0.25%和12.58-135.54%，共有峰保留時間的重復(fù)性較好，但是峰面積變化范圍較大。

圖2 五常大米乙酸乙酯提取物液相多點校正圖譜

圖3 五常大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜

通過HPLC指紋譜圖相似度分析結(jié)果（表4）可以看出，8個批次的五常大米的乙酸乙酯提取物HPLC譜圖除S8樣品的相似度低于0.9以外，其他7個樣品與生成對照指紋圖譜的相似度均高于0.969，說明五常大米乙酸乙酯提取物的指紋圖譜具有很好的代表性，可反映絕大部分五常大米的信息。

表3 大米乙酸乙酯提取物液相指紋色譜共有峰數(shù)據(jù)

表4 五常大米乙酸乙酯提取物HPLC圖譜相似度分析結(jié)果

2.3.2 在五常大米鑒別中的應(yīng)用

將非五常產(chǎn)區(qū)的大米乙酸乙酯提取物液相色譜和五常大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜共同導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究（2004A版）》，剪切到71min后的色譜峰，以五常大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜為參照圖譜，多點校正，并計算相似度（見表5），可得非五常產(chǎn)區(qū)的大米樣品相似度均低于0.9。因此，以與五常大米乙酸乙酯提取物指紋圖譜相似度高于0.9為標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確鑒別五常大米和非五常大米。

3. 結(jié)論

通過對五常大米和非五常大米共17個樣品的研究，得出以下結(jié)論：

（1）大米乙酸乙酯提取物的高效液相色譜分析方法，具有良好的精密度。

（2）利用實驗可得到標(biāo)準(zhǔn)五常大米指紋圖譜，用該圖譜對大米樣品進(jìn)行分析，以相似度大于0.9為標(biāo)準(zhǔn)，可以準(zhǔn)確判斷五常大米和非五常大米。