黃芪多糖納米粒的構(gòu)建及特征*

許小英，周存敏，譚榜云，陳 琳，朱海平

蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘭州730000

黃芪多糖（APS）是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等多種酸性多糖組成的親水性大分子混合物[1]。這種大分子物質(zhì)很難穿透細(xì)胞膜或只有很少部分通過細(xì)胞間隙被吸收[2]，導(dǎo)致APS 藥效不顯著。目前臨床上主要以靜脈方式給藥，尚存在不明確的過敏風(fēng)險。口服給藥是中醫(yī)藥常用的經(jīng)典而有效的途徑，也是患者最易接受的給藥方式，但APS 自帶負(fù)電荷，口服給藥會造成其與腸黏膜形成靜電排斥，嚴(yán)重阻礙其在胃腸道的滲透作用，導(dǎo)致生物利用度更低[3]。尋求促進(jìn)親水大分子中藥吸收的方法成為研究的焦點(diǎn)。

近年來，借助納米粒子（NPs）較強(qiáng)的細(xì)胞穿透和靶向能力、高效的藥代動力學(xué)、良好的生物相容性等優(yōu)勢，納米中藥制劑已成為一種很有前途的新型藥物[4]。納米中藥制劑是利用納米載體粒徑小、比表面積大、表面活性高、吸附能力強(qiáng)等特性，通過物理或化學(xué)作用，將中藥吸附或包埋在納米粒子上構(gòu)成的復(fù)合物。該復(fù)合物具有主動或被動靶向作用，使藥物聚積于病灶部位，顯著提高藥物的生物利用度，且在保證藥物效應(yīng)的前提下可降低給藥劑量，從而減輕或避免中藥的毒副反應(yīng)[5]。殼聚糖（CS）納米粒子（以下簡稱CS-NPs）是一種常用的中藥納米制劑的載體。

本實(shí)驗(yàn)主要以CS-NPs 為載體制備APS 納米粒，有望成為臨床治療的新工具。首先確定APS-CS NPs 制備的最佳條件，再按照文獻(xiàn)方法檢測該納米粒的紅外吸收光譜、粒徑、Zeta 電位、分散指數(shù)等數(shù)據(jù),以表征其大小、分布及穩(wěn)定性等物理特性[6]。最后將APS-CS NPs 與大鼠心肌細(xì)胞系（H9c2 細(xì)胞）共培養(yǎng)，利用細(xì)胞活力變化評價該藥物的細(xì)胞相容性，為該藥物臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪多糖（APS）BR，90%（Sigma，美國）；殼聚糖（CS，脫乙酰度≥90%,細(xì)度80 目（濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司）；三聚磷酸鈉（TPP，分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司）；高糖DMEM 干粉、培養(yǎng)基胎牛血清（均GIBCO 公司，美國）；H9c2 細(xì)胞細(xì)胞株（ATCC 細(xì)胞庫，美國）。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano ZS 粒度分析儀（馬爾文公司，英國）；紫外可見分光光度計（日本電子公司）；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（SANYO 公司，日本）；RT-6000 酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份公司）；SPECTRUM 1000紅外光譜儀（Pontypool，英國）；BI-2005M 激光光散射儀（布魯克海文公司，美國）。

1.3 APS-CS NPs 的制備

1.3.1 確定CS 和TPP 濃度 不同濃度的CS 和TPP,形成納米載體的粒徑不同。在磁力攪拌下，將0.5～2 mg·mL-1的TPP 溶液分別逐滴加入不同濃度的CS 溶液中（1～2.5 mg·mL-1），滴加完畢后繼續(xù)攪拌10 min，所得納米水分散體的粒徑用激光粒度分析儀測定,即可確定最小粒徑時CS 和TPP 的濃度。

1.3.2 確定APS 含量 不同含量的APS 會影響APSCS NPs 納米粒的包封率，確定包封率達(dá)到最高時APS 的投入量，以獲得最佳包封率的APS-CS NPs 納米粒。將不同含量的APS（2.5～20 mg）分別加入CSNPs 納米水分散體系，室溫下磁力攪拌過夜。16000r·min-1超速離心60 min 后，取上清液0.5 mL，用95%的乙醇溶解定容于10 mL 量瓶中，用于游離APS 量的測定。游離APS 量測定方法如下：在200～800 nm范圍內(nèi)用紫外可見分光光度計進(jìn)行掃描，確定上清液中游離APS 的最大吸收波長，然后在該波長下測定同體積不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg·mL-1）APS 標(biāo)準(zhǔn)溶液和上清液游離APS 的吸光度值，通過APS 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，計算上清液游離APS 吸光度值所對應(yīng)的濃度值，即為上清液中游離APS 的濃度。應(yīng)用下述公式計算APS-CS NPs 納米粒的包封率 （encapsulating capacity，EE）：EE%=（m總APS投入量-m上清游離APS量）/m總APS投入量×100%。

1.3.3 采用最佳工藝制備APS-CS NPs 納米粒 按照上述確定的CS 及TPP 濃度，分別配制殼聚糖溶液及TPP 溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，在磁力攪拌下，將TPP 溶液逐滴加入殼聚糖醋酸溶液中，滴加完畢再繼續(xù)攪拌10 min，然后加入上述確定濃度的APS，室溫下磁力攪拌過夜，超速離心（16000 r·min-1）60 min，棄上清液，沉淀物用75%乙醇、蒸餾水各洗3 遍，將得到的沉淀物于-80 ℃冷凍24 h 后，再用真空冷凍干燥機(jī)干燥成粉末，備用。

1.4 APS-CS NPs 的理化性質(zhì)表征

1.4.1 紅外光譜分析 通過比較APS、CS-NPs 納米載體、APS-CS NPs 納米粒紅外光譜吸收峰的差別，判斷APS 是否成功包埋在CS-NPs 納米載體上。取干燥的APS、CS-NPs 納米粒子、APS-CS NPs 納米粒各2.0 mg，用瑪瑙研缽研細(xì)，加入100～200 mg 磨細(xì)的干燥溴化鉀粉末，混和均勻裝入模具內(nèi)，在壓片機(jī)上壓制成片，用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜分析，并應(yīng)用origin 8.0 軟件繪制紅外光譜圖。

1.4.2 平均粒徑測定 應(yīng)用激光粒度分析儀測定制備的APS-CS NPs 納米粒的平均大小及分布。將凍干的APS-CS NPs 納米粒分散在去離子水中，超聲分散均勻，用激光粒度分析儀測定納米粒粒徑，得到粒徑分布圖。

1.4.3 Zeta 電位測定 采用Zeta 電位儀測定APSCS NPs 納米粒的Zeta 電位，分析該納米粒所帶電荷。將凍干的APS-CS NPs 納米粒分散在去離子水中，超聲分散均勻，用Zeta 電位儀分別檢測APS-CS NPs 納米粒的Zeta 電位。

1.5 細(xì)胞相容性評價

為驗(yàn)證APS-CS NPs 納米粒是否具有細(xì)胞毒性，將濃度為10～50 μg·mL-1的APS-CS NPs 納米粒與H9c2 細(xì)胞共同培養(yǎng)24、48、72 h 后，分析細(xì)胞增值率變化，評價該藥物的細(xì)胞相容性。常規(guī)培養(yǎng)H9c2 細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液中，并置于溫度37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)2天后，取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/孔，接種至96 孔板上，每孔加入100 μL，培養(yǎng)4 h后待細(xì)胞貼壁后，將所得細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，分別向?qū)嶒?yàn)孔加入終濃度為10～50 μg·mL-1的APS-CS NPs 納米粒，對照孔則加入等體積的PBS，兩組細(xì)胞均培養(yǎng)24、48、72 h。然后每孔加入10 μL MTT（0.5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，去除上清液,每孔加入200 μL DMSO，避光振蕩10 min 使結(jié)晶充分溶解，采用酶標(biāo)儀在570 nm 波長處測定每孔光吸收值（Optical Density，OD），重復(fù)3 次，每次做5 個復(fù)孔取平均值。將對照組的細(xì)胞增值率定為100%，細(xì)胞增值率（%）＝（A對照組－A實(shí)驗(yàn)組）/A對照組×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

以SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行結(jié)果分析，所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同條件對APS-CS NPs 納米粒粒徑及包封率的影響

2.1.1 CS 和TPP 濃度對制備的APS-CS NPs 納米粒粒徑的影響 在CS-NPs 納米載體制備過程中，CS 和TPP 濃度對能否形成納米粒，以及形成的納米粒的粒徑有較大影響，見表1。

表1 CS 和TPP 濃度對納米粒粒徑的影響

當(dāng)加入的CS 濃度小于2 mg·mL-1、TPP 濃度為0.5mg·mL-1時，生成的納米粒子數(shù)量太少，溶液清亮。當(dāng)CS 濃度為2.5mg·mL-1、加入的TPP 濃度為2 mg·mL-1時，CS-NPs 出現(xiàn)聚集，形成絮狀沉淀。而不同濃度的CS 和TPP 形成的CS-NPs 納米粒的平均粒徑差異較大，CS-NPs 納米載體的粒徑并沒有隨著CS 和TPP 濃度的增大而增大，且規(guī)律性不強(qiáng)。但綜合考慮減小粒徑可形成較多的納米載體，以利于對藥物的包封，故選擇納米載體平均粒徑最?。?7.4±3.16）nm 時，CS 濃度為2mg·mL-1，TPP 濃度為1mg·mL-1做下一步研究。

2.1.2 APS 濃度對制備的APS-CS NPs 納米粒包封率的影響 考察不同APS 濃度對APS-CS NPs 納米粒包封率的影響，確定最大包封率時APS 的投入量。首先應(yīng)用紫外分光光度法確定APS 紫外吸收波長，對APS 標(biāo)準(zhǔn)溶液在200～800 nm 進(jìn)行全波段掃描，在275 nm 處產(chǎn)生最大吸收峰，無干擾峰存在，因此選定275 nm 作為APS 紫外吸收波長。然后在此波長下，測定0.02～0.10 mg·mL-1APS 標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，以峰面積A 對濃度C 做線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.715C-0.0017，r2=0.9990，結(jié)果顯示，APS在0.02～0.10 mg·mL-1線性良好。最后根據(jù)公式計算包封率，結(jié)果顯示，當(dāng)APS 用量小于10 mg 時，包封率隨APS 用量增大急劇升高，CS 與TPP 離子凝膠化過程中對APS 的捕捉率也相應(yīng)提高；而當(dāng)用量繼續(xù)增大時，包封率又有所下降；當(dāng)APS 投藥量為10 mg時，得到的包封率最高，為89.20%。見圖1。

綜上所述，制備APS-CS NPs 納米粒的最佳工藝條件是：CS 濃度為2 mg·mL-1，TPP 濃度為1 mg·mL-1，APS 濃度為1 mg·mL-1。

2.2 APS-CS NPs 納米粒物理特征

2.2.1 紅外吸收光譜 通過解析APS、CS-NPs 納米載體、APS-CS NPs 納米粒的紅外光譜差異，可判斷APS 是否結(jié)合在CS-NPs 納米載體上。如圖2 所示，APS-CS NPs 納米粒紅外光譜圖的特征頻率：2934.6、1637.9、1537.6、1228.3、1094.7、618.3 cm-1。其中，2934.6 cm-1是CH2反對稱伸縮吸收峰，1637.9 cm-1是C=C 伸縮吸收峰，1537.6 cm-1是NH3+對稱變角吸收峰，1228.3 cm-1是C-O-C （酯） 反對稱伸縮吸收峰，1094.7 cm-1是C-O 伸縮吸收峰，618.3 cm-1為CO2剪式振動吸收峰。與CS-NPs 納米載體的紅外光譜圖相比，特征吸收峰基本一致，但APS-CS NPs 納米粒在618.3 cm-1出現(xiàn)特征吸收峰，對照APS紅外吸收光譜，可知此處為APS 特征性吸收峰，由此可以推斷：CS-NPs 納米載體中含有APS，APS-CS NPs 納米粒制備成功。

2.2.2 納米粒平均粒徑 選擇CS 濃度為2mg·mL-1、TPP 濃度為1 mg·mL-1、APS 為10 mg 的條件下，制備的APS-CS NPs 納米粒水分散體系經(jīng)激光粒度分析儀測定，確定該納米粒的粒徑大小及粒徑分布。從圖3 可以看出，APS-CS NPs 納米粒的平均粒徑為112.4 nm，粒徑分布比較均一。

2.2.3 Zeta 電位 采用Zeta 電位儀測定APS-CS NPs 納米粒的Zeta 電位，分析該納米粒所帶電荷，結(jié)果如圖4 所示，APS-CS NPs 納米粒表面帶正電荷，電位為（41.0±0.21）mV，粒度穩(wěn)定性較好。

2.3 APS-CS NPs 納米粒具有良好的細(xì)胞相容性

采用MTT 法檢測APS-CS NPs 納米粒濃度為10～50 μg·mL-1時細(xì)胞的活性，其吸光度如圖5 所示，當(dāng)APS-CS NPs 納米粒濃度提高至50 μg·mL-1時，細(xì)胞增殖率仍保持在100%以上，呈增值狀態(tài)，APS-CS NPs 納米粒對細(xì)胞增殖率的影響無顯著性差異（P=0.557）。結(jié)果表明，當(dāng)APS-CS NPs 納米粒濃度小于等于50 μg·mL-1時，具有良好的生物相容性，對H9c2 細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用。

3 討論

為提高口服途徑APS 的吸收率，本實(shí)驗(yàn)采用CS-NPs 作為納米載體，吸附APS 制備出APS-CS NPs 納米粒。首先通過檢測CS-NPs 納米粒徑考察了制備APS-CS NPs 納米粒最佳的CS 濃度和TPP濃度。CS 與TPP 的反應(yīng)主要通過帶正電荷的氨基和帶負(fù)電荷磷酸基之間的靜電引力作用，因此不同濃度的CS 與TPP 在反應(yīng)中所占基團(tuán)的比例也不同，會影響納米粒子的形成及納米粒子的粒徑[7]。由表1 可見，當(dāng)CS 濃度為1mg·mL-1、TPP 濃度為2mg·mL-1時，制備的CS-NPs 納米載體粒徑最小，為（67.4±3.16）nm，與以往的研究結(jié)果基本一致[8，9]。另外如若納米粒包載APS 的量太少起不到藥效，若APS 量太高則納米粒包載不了，因此，需進(jìn)一步考察不同APS 濃度對包封率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)APS 用量小于10 mg 時，包封率隨APS 用量增大急劇升高，CS 與TPP 離子凝膠化過程中對APS 的捕捉率也相應(yīng)提高；而當(dāng)用量繼續(xù)增大時，包封率又有所下降，這是因?yàn)榇藭r體系中APS 的濃度已經(jīng)足夠高，包封率的大小已經(jīng)不受APS 加入量的限制，而是受到納米粒形成量的限制。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)APS 投藥量為10 mg 時可得到較高的包封率，即包封率為89.20%，與Vimal S 等[10]制備的DNA-CS-NPs 納米粒子（79.9%）均具有較高的包封率。

APS 作為配體，是否與CS-NPs 納米載體結(jié)合，需要對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。紅外吸收光譜主要反映化合物中官能團(tuán)。對比APS、CS-NPs 納米載體和APSCS NPs 納米粒的紅外光譜發(fā)現(xiàn)，APS-CS NPs 納米粒的紅外光譜與CS-NPs 納米載體的紅外光譜比較相似，而與APS 的紅外光譜存在明顯差異，這是因?yàn)楸M管APS 已達(dá)到最大包封率，吸附在CS-NPs 納米載體上，但在APS-CS NPs 納米粒中仍以CS-NPs 為主。在APS-CS NPs 納米粒的紅外光譜圖中，618.3 cm-1出現(xiàn)新的特征峰，說明APS 與CS-NPs 納米載體之間相互作用，APS-CS NPs 納米粒制備成功。

本實(shí)驗(yàn)對制備的APS-CS NPs 納米粒進(jìn)行理化特性表征。Zeta 電位通常用來表征納米顆粒的表面電荷性質(zhì)，它還可以進(jìn)一步用于探測帶電的活性分子是包裹在納米顆粒的中心還是表面[11]。APS 在蒸餾水中的Zeta 電位為-13 mV，CS-NPs 納米載體Zeta 電位為（41±0.82）mV[12]，APS-CS NPs 納米粒和CS-NPs 納米載體相同，Zeta 電位均為正，說明負(fù)的APS 分子是包埋在APS-CS NPs 納米粒的中心。納米粒子的Zeta 電位在±30 mV 以上被認(rèn)為在懸浮狀態(tài)下是穩(wěn)定的[13]，因?yàn)榱Ｗ又g的電荷排斥足以抑制聚集和結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)制備的APS-CS NPs 納米粒Zeta 電位值在40 mV 左右，認(rèn)為具有穩(wěn)定性。

最后測定不同濃度的APS-CS NPs 納米粒對H9c2 細(xì)胞株的生物相容性，結(jié)果表明，當(dāng)APS-CS NPs 納米粒濃度小于等于50 μg·mL-1時，對H9c2細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒作用，且APS-CS NPs 納米粒濃度為50 μg·mL-1時，細(xì)胞增值率最高，因此，本實(shí)驗(yàn)成功制備出APS-CS NPs 納米粒，該納米粒對細(xì)胞具有良好的相容性，可用于體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)研究。