基于UPLC-QTOF-MS/MS 法的茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)化學成分分析*

周 潔，湯維維，陳 君

中國藥科大學中藥學院生藥學系，南京210009

蒼術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea（Thunb.） DC.或北蒼術(shù)Atractylodes chinensis（DC.） Koidz.的干燥根莖，為2020 版《中國藥典》所收錄，可燥濕健脾、祛風散寒、明目，用于脘腹脹滿、泄瀉、水腫、風濕痹痛、風寒感冒、眼目昏澀等癥[1]?，F(xiàn)代藥理實驗研究表明，蒼術(shù)具有多種生物學活性，如調(diào)整胃腸道運動、降血糖、抗?jié)兗翱咕椎萚2-4]。蒼術(shù)中含有多種結(jié)構(gòu)類型的化學成分，包括萜類、聚乙烯炔類、三萜及甾體類、芳香族及糖苷類等[5，6]。目前，國內(nèi)外對蒼術(shù)中倍半萜及烯炔類等揮發(fā)性成分的研究較為深入，而對蒼術(shù)中非揮發(fā)性成分的研究相對較少報道[7，8]。為明晰蒼術(shù)藥材的固有化學成分，有必要對其含有的非揮發(fā)性成分進行深入研究，以建立較為完善的蒼術(shù)質(zhì)量評價體系。

本實驗采用UPLC-QTOF-MS/MS 方法對茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)75%甲醇提取物中的化學成分進行快速分析，通過高分辨質(zhì)譜獲得各成分的液相色譜保留時間、精確分子質(zhì)量和特征碎片離子信息，并結(jié)合對照品及相關(guān)文獻數(shù)據(jù)比對進行成分鑒定[9-13]，可為蒼術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

Agilent 1290 UPLC-6530 QTOF-MS/MS（美國Agilent 公司）；BT-25S 型電子分析天平（0.01 mg，德國Satarious 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

對照品：綠原酸（批號：MUST-17030620）、新綠原酸 （批號：MUST-17011001）、隱綠原酸 （批號：MUST-17022403）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ （批號：MUST-17030201）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號：MUST-17030202）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號：MUST-17030203）均購自成都曼思特生物科技有限公司（純度均>98%）。本實驗所用茅蒼術(shù)藥材（Atractylodes lancea （Thunb.） DC.）產(chǎn)地湖北，北蒼術(shù)藥材（Atractylodes chinensis （DC.）Koidz.）產(chǎn)地內(nèi)蒙古，均購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)中國藥科大學生藥學系劉惠娟實驗師鑒定確認。

甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（色譜純，美國ROE 公司）；去離子水 （18 MΩ）由Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）制備。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

分別稱取適量的綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品，置于2 mL 量瓶中，加入適量甲醇溶解、定容至刻度，混勻，即得對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取蒼術(shù)干燥粉末（過3 號篩）2.0 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入75%甲醇40 mL，加塞密封后稱重，超聲提取40min（功率250W、頻率40kHz），冷卻至室溫，搖勻靜置后再稱重，用75%甲醇補足失重，離心10 min（4 ℃，13 000 r·min-1）后，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

采用Agilent Infinity Lab Poroshell 120EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 色譜柱分離；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），采用梯度洗脫，洗脫程序為0～2 min，10%B；2～6 min，10%～14%B；6～9 min，14%～25%B；9～12 min，25%～60%B；12～20 min，60%～72%B；20～22 min，72%～90% B；22～24 min，90%～100%B；24～26 min，100%B。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣體積：1 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），在正、負離子模式下分別采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍：50～1500 m/z。ESI 離子源參數(shù)： 干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L·min-1；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：10 L·min-1；霧化氣壓力：241.3 kPa；毛細管電壓：正離子模式4000 V、負離子模式3500 V；裂解電壓：120 V；碰撞能量：5、10、20、40 eV。

在進樣分析前，利用調(diào)諧液對QTOF-MS/MS 的質(zhì)量軸進行校正，數(shù)據(jù)采集過程中采用參比離子進行實時校準。在正離子模式下選擇m/z 121.050 8 與m/z 922.009 8 離子作為實時校正質(zhì)量數(shù)；負離子模式下選擇m/z 112.988 5 與m/z 1 033.988 1 離子作為實時校正質(zhì)量數(shù)。質(zhì)譜檢測時與理論相對分子質(zhì)量數(shù)誤差應(yīng)小于±5 ppm。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-QTOF-MS/MS 分析

運用建立的UPLC-QTOF-MS/MS 方法對茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)75%甲醇提取物進行分析。圖1～2 分別為茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)提取物在正、負離子模式下的總離子流圖（TIC）。

采用對照品比對化合物極性大小、質(zhì)譜裂解規(guī)律及特征碎片離子分析，以及比對相關(guān)化合物結(jié)構(gòu)鑒定文獻及數(shù)據(jù)庫查閱等方法，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行解析。此外，質(zhì)譜檢測時分別設(shè)定5、10、20、40 V 四個二級電壓，通過比較不同電壓時的離子豐度，快速尋找化合物的特征碎片離子。所鑒定化合物的保留時間（tR）、相對分子質(zhì)量、分子式、質(zhì)量偏差（ppm）以及特征碎片等信息見表1、表2。

從茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)中均鑒定出78 個化學成分，包括16 個萜類化合物、10 個聚乙烯炔類化合物、25 個有機酸類化合物、17 個糖苷類化合物和10個其它類化合物。

3.2 化合物鑒定

3.2.1 單萜及倍半萜類 在ESI+模式下，單萜類化合物如峰12 得到m/z 179[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 161[M+H-H2O]+，m/z 151[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為（4R，S）-4-isopropyl-trans-bicyclo[4.3.0]-2-nonen-8-one。桉葉烷型結(jié)構(gòu)的倍半萜類化合物較多，一般以母核脫H2O，CO 為主，產(chǎn)生m/z 175 的特征碎片離子，通過對各峰的分子離子峰及二級質(zhì)譜分析，可見峰7、8、10、13、20、22、23、24、25、28、32 均有脫去H2O 及CO等基團后的特征碎片離子，以峰25 為例，在ESI+模式下得到m/z 231[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 213[M+H-H2O]+，m/z 203[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與對照品對比，鑒定其為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。采用類似的方法，通過比較得到的母離子和二級質(zhì)譜信息，推測峰7 為eudesm-4（15），7-diene-9α，11-diol，峰8 為eudesm-4（15），7-diene-11-ol-9-one，峰10 為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，峰13 為白術(shù)內(nèi)酰胺，峰20 為3β-羥基蒼術(shù)酮，峰22 為白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，峰23 為8βethoxyasterolid，峰24 為8β-甲氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，峰28 為芹子二烯酮，峰32 為蒼術(shù)酮。此外，峰27 得到m/z 259[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 231[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[11]對比，鑒定其為7-methoxy-2-methyl-2-（4-methylpent-3-enyl）-2Hchromene。峰29 得到m/z 215[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 197[M+H-H2O]+，m/z 187[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為呋喃二烯酮。峰34 得到m/z 259[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 241[M+H-H2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[11]對比，鑒定其為2-（3，7-dimethylocta-2，6-dien-1-yl）-6-methylcyclohexa-2，5-diene-1，4-dione。在ESI-模式下，峰33 得到m/z 231[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 187[M-H-CO2]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10，12]對比，鑒定其為木香烴內(nèi)酯。

表1 蒼術(shù)提取物的UPLC-QTOF-MS/MS 定性分析結(jié)果（正離子模式)

續(xù)表1 蒼術(shù)提取物的UPLC-QTOF-MS/MS 定性分析結(jié)果（正離子模式)

表2 蒼術(shù)提取物的UPLC-QTOF-MS/MS 定性分析結(jié)果（負離子模式）

續(xù)表2 蒼術(shù)提取物的UPLC-QTOF-MS/MS 定性分析結(jié)果（負離子模式）

3.2.2 聚乙烯炔類 在ESI+模式下，峰6 得到m/z 217[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 203[M+H-CH2]+，m/z 199[M+H-H2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為（4E，6E，12E）-tetradecatriene-8，10-diyne-1，3-dio。峰9、16、19 得到m/z 183[M+H]+，三者為同分異構(gòu)體，其二級質(zhì)譜得到m/z 165[M+H-H2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9，10]對比，推測分別為7-phenyl-2-heptene-4，6-diyn-1-ol、（1Z）-蒼術(shù)素和蒼術(shù)素。峰15 得到m/z 289[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 271[M+H-H2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為二乙酰蒼術(shù)素醇。峰18 得到m/z 359[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 341[M+H-H2O]+，m/z 323[M+H-2H2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9，10]對比，鑒定其為（4E，6E，12E） -1 -acetoxy -3 -isovaleryloxytetradeca -4，6，12-trien-8，10-diyn-14-ol。峰21 得到m/z 241[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 213[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為乙酰蒼術(shù)素醇。峰26 得到m/z 303[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 261[M+H-C3H6]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9，10]對比，鑒定其為（6E，12E）-tetradecadiene-8，10-diyne-1，3-diol-diacetate。峰31 得到m/z 301[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 283[M+H-H2O]+，m/z 259[M+H-C3H6]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9，10]對比，鑒定其為（4E，6E，12E）-tetradecatriene-8，10-diyne-1，3-diol-diacetate。峰33 得到m/z 275 [M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 257 [M+HH2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9，10]對比，鑒定其為2-[（2'E）-3'，7'-dimethyl-2'，6'-octadienyl]-4-methoxy-6-methylphenol。

3.2.3 有機酸類 在ESI+模式下，峰6 得到m/z 169[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 151[M+H-H2O]+，m/z 141[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為香草酸。在ESI-模式下，峰1 得到m/z 191[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 173[M-HH2O]-，m/z 155[M-H-2H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[13]對比，鑒定其為奎寧酸。峰2 得到m/z 133[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 115[M-H-H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12，13]對比，鑒定其為蘋果酸。峰12 得到m/z 337[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 191 奎寧酸特征性碎片離子，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[13]對比，鑒定其為肉桂?？鼘幩?。峰22得到m/z 193[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 149[MH-CO2]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12，13]對比，鑒定其為阿魏酸。峰27 得到m/z 187[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 169[M-H-H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12，13]對比，鑒定其為壬二酸。峰31得到m/z 329[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 311[MH-H2O]-，m/z 293[M-H-2H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12，13]對比，鑒定其為三棱酸。峰32 得到m/z 263[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 235[M-HCO]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為naphthol。峰38 得到m/z 455[M-H]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，推測為齊墩果酸。峰39 得到m/z 227[M-H]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，推測為肉豆蔻酸。峰3、7、9 在ESI-模式下得到m/z 353[M-H]-，三者為同分異構(gòu)體，均為單咖啡酰奎寧酸類化合物，并且具有m/z 191、179和135 的特征性碎片離子，通過參考相關(guān)文獻及與對照品比對，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的極性依次降低，鑒定化合物3、7、9 分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸。峰8、15、18 在ESI-模式下分子離子峰均為367，具有m/z 191、179、135 的特征性碎片離子，該化合物可能為阿魏?？鼘幩犷?，參考其在反相色譜柱的洗脫規(guī)律，進而判斷上述化合物分別為5-O-阿魏?？鼘幩帷?-O-阿魏?？鼘幩?、4-O-阿魏?？鼘幩?。峰14、26、28 在ESI-模式下分子離子峰均為515，均會失去兩分子咖啡?；?、生成m/z 353 的碎片離子峰，繼續(xù)裂解產(chǎn)生m/z 191、179 的特征碎片離子，推斷化合物14、26 和28 分別為異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C。峰36 得到m/z 295[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 277[M-H-H2O]-，m/z 259[M-H-2H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[11]對比，鑒定其為9，10-環(huán)氧-12（Z）-十八碳烯酸。峰37 得到m/z 293[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 275[M-H-H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[11]對比，鑒定其為（9Z，11E，15Z）-13-羥基-9，11，15-十八碳三烯酸。峰41、42、43、44 的二級質(zhì)譜中產(chǎn)生一系列m/z 相差14 的碎片離子峰，推測其可能為鏈狀結(jié)構(gòu)，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10，11]對比，推測其分別為十八碳-9，12-二烯酸、十六碳烯酸、棕櫚酸和十八碳-9-烯酸。

3.2.4 糖苷類 在ESI-模式下，峰6 得到m/z 331[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 285[M-H-CH2O2]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為（1R，2R，4S）-2-hydroxy-1，8-cineole-β-D-glucopyranoside。峰20 得到m/z 371[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 335[M-H-2H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9，10]對比，鑒定其為紫丁香苷。峰40 得到m/z 397[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 379[M-H-H2O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為（5R，7R，10S） -isopterocarpolone -β -D -glucopyranoside。峰4、5、13、19、23、24、25、29、30 均有脫去葡糖基 （Glc）m/z 162 后的特征碎片離子，以峰5 為例，在ESI-模式下得到m/z 447[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 285[M-H-C6H10O5]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為蒼術(shù)苷A。采用類似的方法，通過比較得到的母離子和二級質(zhì)譜信息，推測峰4 為（1R，4S，6R）-1，3，3-trimethyl-2-oxabicyclo [2.2.2]oct-6-yl-6-O-β-D-glucopyranosyl-β-Dglucopyranoside，峰13 為 （1S，4S，5S，7R，10R）-10，11，14-trihydroxyguai-3-one-11-O-β-D-glucopyranoside，峰19 為蒼術(shù)苷I，峰23 為蒼術(shù)苷F，峰24 為蒼術(shù)苷E，峰25 為 （1S，5R，7R，10R）-secoatractylolactone-11-O-β-D-glucopyranoside，峰29 為蒼術(shù)苷G 2-O-β-D-glucopyranoside，峰30 為蒼術(shù)苷G。峰10、11、16、17、21 均有脫去芹糖基（Api）m/z 132 或芹糖基-（1→6）葡糖基（Api1—6Glc）后的特征碎片離子，以峰17 為例，在ESI-模式下得到m/z 709[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 577[M-H-C5H8O4]-，m/z 415[M-H-C5H8O4-C6H10O5]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為蒼術(shù)苷H。采用類似的方法，通過比較得到的母離子和二級質(zhì)譜信息，推測峰10 為二氫紫丁香苷，推測峰11 為淫羊藿次苷F2，推測峰16 為淫羊藿次苷D1，推測峰21 為（2E）-decene-4，6-diyne-1，8-diol-8-O-β-D-apiofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside。

3.2.5 其它類 在ESI+模式下，峰1 得到m/z 166[M+H]+，峰3 得到m/z 205[M+H]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[9]對比，鑒定其分別為L-苯丙氨酸、D-色氨酸。峰4 得到m/z 177[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 159[M+H-H2O]+，m/z 149[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12]對比，鑒定其為羥甲香豆素。峰5 得到m/z 193[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 165[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為莨菪亭。峰11 得到m/z 163[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 135[M+H-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為黃樟素。峰14得到m/z 127[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 109[M+H-H2O]+，m/z 81[M+H-H2O-CO]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為5-羥甲基-2-呋喃甲醛。峰17 得到m/z 197[M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 167[M+H-CH2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[11]對比，鑒定其為2-（聯(lián)苯基-4-基）乙醛。峰30 得到m/z 279 [M+H]+，其二級質(zhì)譜得到m/z 261[M+H-H2O]+，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[10]對比，鑒定其為鄰苯二甲酸二丁酯。

在ESI-模式下，峰34 得到m/z 723[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 677[M-H-CH2O2]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12]對比，鑒定其為（8Z，8'Z）-1，1'，6，6' -tetrahydroxy -5，5' -diisopropyl -3，3' -dimethyl-8，8'-bis{[（1-phenylethyl）amino]methylene}-2，2'-binaphthalene-7，7'（8H，8'H）-dione。峰35 得到m/z 677[M-H]-，其二級質(zhì)譜得到m/z 593[M-HC5H8O]-，結(jié)合精確相對分子質(zhì)量及與文獻[12]對比，鑒定其為galnon。

4 討論

本實驗對蒼術(shù)藥材的提取條件進行了優(yōu)化，最終采用75%甲醇作為提取溶劑、超聲提取40 min 的方法，該方法具有提取時間短、提取效率高的特點。為了獲取更豐富的離子信息，更加全面地推測化合物的結(jié)構(gòu)，本實驗同時選用了正、負離子兩種質(zhì)譜掃描模式。另外，通過考察不同流動相體系，最終選用了能有效改善峰形和離子化效果的0.1%甲酸溶液作為水相。

蒼術(shù)中化學成分較為復雜，各類成分的極性相差較大，通過優(yōu)化洗脫條件，使盡可能多的成分在色譜柱上實現(xiàn)較好分離。

本研究采用UPLC-QTOF-MS/MS 聯(lián)用技術(shù)對兩種蒼術(shù)基原藥材的化學成分進行了快速定性分析，結(jié)合各成分在正、負離子模式下的精確分子質(zhì)量、碎片離子以及保留時間等信息，并通過對照品以及現(xiàn)有文獻和相關(guān)數(shù)據(jù)庫比對分析，從茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)75%甲醇提取物中共鑒定出78 個化學成分，其中包括16 個萜類化合物、10 個聚乙烯炔類化合物、25 個有機酸類化合物、17 個糖苷類化合物、10 個其它類化合物。

茅蒼術(shù)與北蒼術(shù)中均鑒定得到78 個共有化學成分，各成分相對含量上存在差異，但未鑒定得到非共有成分，可能系兩者基原存在種屬差異，但在化學成分上并沒有本質(zhì)的差異[10]，后續(xù)可結(jié)合植物代謝組學方法進行差異成分的探討。