冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學中的研究現(xiàn)狀及展望

摘 要：冷凍電鏡技術(shù)近年來獲得了迅猛的發(fā)展，取得了許多具有重大意義的成果。冷凍電鏡將生物分子進行冷凍便可進行高分辨率成像，還具有分辨率高、更接近天然狀態(tài)、適用研究對象廣泛等優(yōu)勢。同時，系統(tǒng)地綜述了冷凍電鏡技術(shù)在科學研究中的應(yīng)用，并展望冷凍電鏡技術(shù)未來的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：冷凍電鏡;結(jié)構(gòu)生物學

中圖分類號：TG115.21+5.3;Q518.3 ?文獻標志碼：A

Abstract Cryo-electron microscopy technology has made rapid development in recent years，and many groundbreaking results has achieved. Cryo-electron microscopy can freeze biomolecules for high-resolution imaging. It also has the advantages of high resolution，closer to the natural state，and a wide range of research objects. At the same time，the application of cryo-electron microscopy technology in scientific research is systematically reviewed and the future development is prospected.

Key words Cryo-electron microscopy;structural biology

冷凍電鏡（cryo-electron microscopy，cryo-EM）技術(shù)，是在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術(shù)，即把樣品冷凍并保持低溫放進顯微鏡里面，用高度相干的電子作為光源從上面照射，透過樣品和附近的冰層，受到散射，再利用探測器和透鏡系統(tǒng)把散射信號成像記錄下來，最后進行信號處理，得到樣品的結(jié)構(gòu)[1]。冷凍電鏡技術(shù)作為一種重要的結(jié)構(gòu)生物學研究方法，它與X射線晶體學、核磁共振一起構(gòu)成了結(jié)構(gòu)生物學研究的基礎(chǔ)。[1]

1 冷凍電鏡技術(shù)的基本原理

1.1 電鏡三維重構(gòu)理論

D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構(gòu)被測物體的立體構(gòu)型，利用計算機數(shù)字圖像處理技術(shù)進行電子顯微像三維重構(gòu)測定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法[2]。

透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運用中心截面定理，從而可以通過三維物體不同角度的二維投影在計算機內(nèi)進行三維重構(gòu)來解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。

1.2 三維冷凍電鏡技術(shù)

樣品經(jīng)過在液氮中的冷凍固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃態(tài)的形式存在，保持低溫，將樣品放入顯微鏡，高度相干的電子作為光源從上面照射下來，透過樣品和附近的冰層，受到散射，利用探測器和透鏡系統(tǒng)把散射的信號成像記錄下來，再進行信號處理，最后利用三維重構(gòu)的技術(shù)得到樣品的三維結(jié)構(gòu)。

2 冷凍電鏡技術(shù)的獨特優(yōu)勢

2.1 分辨率高

光學顯微鏡的分辨率為0.2μm，透射電子顯微鏡的分辨率為0.2nm，透射電子顯微鏡在光學顯微鏡的基礎(chǔ)上放大了1000倍。

2.2 更接近天然狀態(tài)

電子斷層成像技術(shù)則可用來研究一定厚度的亞細胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不需要蛋白質(zhì)結(jié)晶[3]。

2.3 適用研究對象廣泛

冷凍電鏡單粒子法既可以對具有對稱結(jié)構(gòu)的大分子進行研究，也適合于研究結(jié)構(gòu)不規(guī)則的大分子復合物，對于分子量的上限沒有限制，理論上>100kD的分子在成像技術(shù)能夠保證的情況下可以形成足夠的對比以進行圖像校正。

3 冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學中的應(yīng)用

冷凍電鏡技術(shù)主要應(yīng)用在單個蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的分析方面。此外，冷凍電子顯微鏡技術(shù)還將廣泛應(yīng)用于細胞組織的超微結(jié)構(gòu)解析，對解開生命活動的規(guī)律和機制等奧秘會產(chǎn)生更大影響。清華大學生命科學學院王宏偉團隊創(chuàng)造了利用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)解析至近原子分辨率的分子量最小的生物大分子的記錄[4]。施一公研究組解析了γ-secretase蛋白質(zhì)和RyR-1蛋白質(zhì)[5]。楊茂君研究組解析了Mammalian respirasome蛋白質(zhì)[6]。隨著越來越多蛋白質(zhì)神秘面紗的揭開，我們可以更好地解釋各種各樣的生命活動發(fā)生的原因和機理。利用冷凍電鏡技術(shù)觀察到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，我們可以定向改造或構(gòu)建新的蛋白質(zhì)用于科研或醫(yī)療領(lǐng)域。

4 總結(jié)與展望

冷凍電鏡技術(shù)具有分辨率高、更接近天然狀態(tài)、適用研究對象廣泛等特點，越來越多的科學家開始把冷凍電鏡技術(shù)作為研究的一個新方向。冷凍電鏡技術(shù)與X射線技術(shù)和核磁共振技術(shù)互相補充，讓絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)都可以被解析。眾多領(lǐng)域的研究者們將在未來冷凍電鏡新的技術(shù)方法的開發(fā)中發(fā)揮重要的作用，成為該技術(shù)的進一步完善與成熟的重要力量。冷凍電鏡領(lǐng)域研究者們則需要以主動開放的態(tài)度吸引其他領(lǐng)域研究者的合作，并積極迎接來自更多領(lǐng)域研究者的挑戰(zhàn)，保持并發(fā)展自己的技術(shù)特長，站在技術(shù)發(fā)展的制高點上選準研究方向，始終在冷凍電鏡的技術(shù)前沿上開疆拓土。

參考文獻

[1] 王宏偉. 冷凍電子顯微學在結(jié)構(gòu)生物學研究中的現(xiàn)狀與展望 [J]. 中國科學：生命科學，2014，44（10）：1020-1028.

[2] 程凌鵬. 生物大分子高分辨率冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù) [J]. 實驗技術(shù)與管理，2018，35（06）：17-22+26.

[3] MAOFU L，ERHU C，DAVID J，et al. Structure of the TRPV1 channel determined by electron cryo-microscopy [J]. Nature：International weekly journal of science，2013，504（7478）：107-112.

[4] 馨婭. 利用冷凍電鏡方法成功解析最小分子量的蛋白質(zhì) [J]. 科學，2019，71（04）：62.

[5] BAI S S，ZHUO L，SUN Y，et al. Physalin B reduce secretion of Aβ by inhibiting phosphorylation of STAT3 via down-regulated expression of β-secretase and γ-secretase [J]. 中國藥理學與毒理學雜志，2019，33（06）：426-427.

[6] GU J，WU M，GUO R Y，et al. The architecture of the mammalian respirasome [J]. Nature，2016，537（7622）.

作者簡介：陳薇，女，1999年出生，本科，生物技術(shù)。