面向培養(yǎng)科研能力的研究與創(chuàng)新實驗設(shè)計與實踐

靳 明， 景雪拳， 韋麗紅， 白國義， 楊瑜濤

（河北大學(xué)a.化學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心；b.化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北保定071002）

0 引 言

實驗教學(xué)是高等教育中的重要實踐教學(xué)環(huán)節(jié)，是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、實踐能力和綜合素質(zhì)的重要教學(xué)手段［1-2］?；瘜W(xué)是一門以實驗為基礎(chǔ)的學(xué)科，實驗教學(xué)在學(xué)生培養(yǎng)方案中占有非常高的比例?；瘜W(xué)實驗教學(xué)對于學(xué)生的知識、能力、思維和素質(zhì)的協(xié)調(diào)發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，在整個化學(xué)教育教學(xué)過程中占有特殊的地位。傳統(tǒng)的實驗教學(xué)是學(xué)生按照教科書提供的實驗方案，在教師的指導(dǎo)下完成實驗，能夠培養(yǎng)學(xué)生的基本實驗技能，但實驗內(nèi)容與科研前和實際應(yīng)用聯(lián)系較少，學(xué)生的創(chuàng)新實踐能力和綜合能力得不到充分的鍛煉和提高。研究與創(chuàng)新實驗是集多學(xué)科性、創(chuàng)新性、研究設(shè)計性和綜合性實驗技能于一體的實驗課程，不僅培養(yǎng)學(xué)生實驗操作技能，關(guān)鍵是縮小學(xué)生所學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)知識與科研、生產(chǎn)實踐中解決實際問題能力之間的差距，達到增強學(xué)生科研能力、實踐能力和創(chuàng)新能力的目標。因此，當前在高校積極開展研究與創(chuàng)新實驗尤為必要，國內(nèi)諸多高校也在此思路上進行了探索和實踐［3-12］。

1 實驗設(shè)計思路

香豆素是一類常見的熒光染料，合成方法簡便，熒光團易于修飾，波長范圍易于拓展，量子產(chǎn)率高，已廣泛應(yīng)用于熒光探針領(lǐng)域。在前期工作的基礎(chǔ)上［13-15］，利用8-羥基久洛尼定和苯并噻唑的剛性平面結(jié)構(gòu)增強了香豆素的熒光母體探針的平面性，設(shè)計了一種新的香豆素-苯并噻唑熒光探針，并以此開展本科生研究與創(chuàng)新實驗。整個實驗過程如下：①通過4 步有機合成反應(yīng)制備探針分子，合成路線如圖1 所示。4 個不同反應(yīng)涉及有機反應(yīng)中的不同化學(xué)反應(yīng)，學(xué)生可利用已掌握的知識或是查閱文獻的方式了解其反應(yīng)機理，利用SciFinder查找反應(yīng)路線，不同組的同學(xué)嘗試不同的反應(yīng)路線，最后對比了解最佳方式；②對探針分子進行分離、純化與表征；③對探針分子的紫外和熒光光譜性質(zhì)進行分析探討。整個實驗過程中，學(xué)生不僅學(xué)習(xí)鞏固了有機化學(xué)和波譜學(xué)理論知識，學(xué)會了抽濾、萃取和硅膠色譜柱等有機化學(xué)基本操作，還掌握了儀器分析化學(xué)中的紫外-可見分光光度計和熒光光譜儀等儀器的使用和Origin 等數(shù)據(jù)處理方法。另外，此實驗還可以通過探針溶液前后顏色變化，把實驗現(xiàn)象和光譜的理論知識結(jié)合起來，讓學(xué)生更直觀地觀察到實驗現(xiàn)象變化，教學(xué)效果良好，有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)科研興趣，提高科研創(chuàng)新能力。

圖1 探針分子的合成路線

2 實驗?zāi)康暮蛯嶒炘噭?、儀器

2.1 實驗?zāi)康?/h3>

通過文獻檢索，學(xué)會中外數(shù)據(jù)庫的使用，了解香豆素衍生物熒光探針的研究進展、合成方法以及應(yīng)用前景；掌握加熱、過濾、重結(jié)晶、萃取、柱層析等基礎(chǔ)的合成實驗方法操作和技能；掌握縮合、成環(huán)、鹵化、氧化等經(jīng)典有機反應(yīng)，并能進行一些簡單的探針設(shè)計；熟練磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、紫外-可見分光光度計和熒光光譜儀等儀器的操作；了解核磁共振儀和質(zhì)譜儀的檢測原理；學(xué)會核磁、質(zhì)譜、紫外和熒光等儀器使用及Origin等數(shù)據(jù)處理和圖譜分析方法；培養(yǎng)學(xué)生獨立分析和解決問題的能力，提高學(xué)生的科研創(chuàng)新能力。

2.2 實驗儀器和試劑

儀器：茄形瓶、磁力攪拌器、油浴盆、層析柱、蛇形冷凝器、錐形瓶、電子天平、循環(huán)水真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、AVANCE Ⅲ型核磁共振儀（瑞士布魯克），Cary 60型紫外-可見分光光度計（美國安捷倫），Cary Eclipse型熒光光譜儀（美國安捷倫）。

試劑：苯酚、丙二酸、三氯氧磷、哌啶、甲苯、8-羥基久洛尼定、正己烷、氫氧化鈉、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），氯化鈉、乙腈、無水乙醇、苯并噻唑鹽、無水硫酸鈉、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、不同陰離子溶液、GSH、Hcy、Cys。

3 實驗實施步驟

3.1 化合物2 的合成

在150 mL圓底燒瓶中加入苯酚（10.6 mmol，1.00 g）和丙二酸（5.3 mmol，0.55 g），接著向其中慢慢加入POCl3（6.15 mmol，0.58 mL），在0 ℃下攪拌30 min，慢慢將混合物加熱至120 ℃，直至沒有HCl氣體生成后，將混合物冷卻至室溫，將反應(yīng)物倒入100 mL 水中，用乙酸乙酯萃取3 次，收集有機相，加入無水硫酸鈉干燥后濃縮得到白色固體化合物2（1.12 g，產(chǎn)率87.5%）。

3.2 化合物3 的合成

將化合物2（4 mmol，1.02 g）置于100 mL圓底燒瓶，加入甲苯（10 mL）溶解，接著加入8-羥基久洛尼定（4 mmol，0.75 g），在110 ℃下攪拌回流10 h，冷卻至室溫，過濾，正己烷洗滌多次得到化合物3（0.94 g，產(chǎn)率91.2%）

3.3 化合物4 的合成

在N2保護下，將POCl3（3 mL）慢慢滴加到無水DMF（3 mL）中，室溫攪拌30 min，得到紅色液體。將紅色溶液逐滴加入到化合物3（3.5 mmol，0.90 g）的DMF（5 mL）溶液中，60 ℃下攪拌10 h后，將反應(yīng)液倒入50 mL 水中，用30%的NaOH 溶液將溶液調(diào)節(jié)至pH ＝5，有大量紅色沉淀產(chǎn)生，過濾，將粗產(chǎn)品進行柱層析分離提純（PE∶EA ＝1∶1）得到紅色固體化合物4（0.76 g，產(chǎn)率72.2%）。

3.4 探針的合成

將化合物4（1. 0 mmol，0. 30 g）和苯并噻唑鹽（1.1 mmol，0.31 mg），用無水乙醇（25 mL）溶解，加熱回流攪拌12 h，將反應(yīng)液冷卻至室溫，抽濾得到固體，用無水乙醇充分洗滌，得到探針化合物1（0.37 g，產(chǎn)率83%）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ8. 33（d，J ＝7.8 Hz，1H），8.17 ～8.23（m，2H），8.03（d，J ＝15.0 Hz，1H），7.82（t，J ＝15.6 Hz，1H），7.73（t，J ＝15.0 Hz，1H），7.41（s，1H），4.18（s，3H），3.42（d，J ＝5.4 Hz，4H），3.72 ～3.77（m，4H），1.88 ～1.91（m，4H），13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ 157.9，151.1，149.9，149.8，146.7，142.1，139.9，129.3，128.1，127.4，124.2，124.1，121.6，116.5，112.9，107. 9，107. 1，104. 9，50. 0，49. 4，35. 9，26.8，20.3，19.5，19.3。

4 結(jié)果與討論

4.1 紫外可見吸收光譜分析

圖2 探針分子（10 μmol／L）對陰離子及小分子生物硫醇（100 μmol／L）的響應(yīng)的紫外光譜圖

4.2 熒光光譜分析

如圖3 所示，在DMF-PBS（v／v ＝1／10，PBS，10 mmol／L，pH 7.4）緩沖溶液中，利用熒光光譜分析了探針分子對上述分析物的識別性能。選擇等吸收點470 nm 為激發(fā)波長，熒光探針在665 nm 處有強的發(fā)射波長，當加入時，762 nm處熒光減弱，556 nm有強的熒光發(fā)射出現(xiàn)，溶液的熒光顏色由紫紅色變?yōu)榫G色，其他分析物并未發(fā)生明顯變化，結(jié)果表明，熒光探針對識別有高選擇性。

圖3 探針分子1（4 μmol／L）對陰離子及小分子生物硫醇（40 μmol／L）的響應(yīng)的熒光光譜圖（激發(fā)波長為470 nm，狹縫：10 nm／10 nm）

圖4 的熒光滴定圖

最后，利用熒光光譜研究了pH 值對探針分子識別性能的影響。如圖5 所示，探針分子在pH 3 ～11 范圍內(nèi)，I665nm／I556nm沒有明顯變化，說明探針分子有良好的耐酸堿性，比較穩(wěn)定，隨著的加入，發(fā)現(xiàn)I665nm／I556nm在pH 6 ～11 范圍內(nèi)發(fā)生明顯變化，表明探針分子在較寬的pH 值范圍內(nèi)，可實現(xiàn)對范圍內(nèi)的識別檢測。

圖5 pH值對探針熒光強度的影響

5 結(jié) 語

通過香豆素—苯并噻唑熒光探針的設(shè)計、合成及對亞硫酸氫根的檢測實驗，學(xué)生掌握了大量的有機化學(xué)和波譜學(xué)理論知識，尤其經(jīng)過最初的設(shè)計、理論論證、實踐實驗檢驗反饋、再次理論指導(dǎo)設(shè)計、實驗再檢驗等理論實踐相互交替輪流驗證中，學(xué)生理論知識得到進一步提高，實驗結(jié)果又進一步驗證理論知識，提高了分析問題解決問題的能力。通過不斷地實驗和儀器的使用及數(shù)據(jù)的處理，增強了學(xué)生的動手能力。查找諸多有機反應(yīng)機理，更是讓學(xué)生親身體會到理論到實際再到理論的過程。

近年來，受該實驗啟發(fā)，學(xué)生求知欲和自主探究問題能力增強。作為本科生，設(shè)計了諸多新穎熒光探針，如識別室內(nèi)甲醛、環(huán)境中硫化物、水中重金屬離子和生物體內(nèi)小分子硫醇等，并多次成功申請到大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目、實驗室開放項目及發(fā)表科研論文［15-16］，提高了學(xué)生的科研能力和創(chuàng)新能力。