活血祛瘀巴布劑體外釋放度及離體小鼠經(jīng)皮滲透行為與動(dòng)力學(xué)考察*

楊全偉，張耕，胡松

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022)

活血祛瘀巴布劑由丹參、骨碎補(bǔ)、赤芍、五加皮、牡丹皮、紅花、甘草等7味中藥組成，為我院中醫(yī)科臨床使用多年的協(xié)定處方，目前臨床應(yīng)用時(shí)將其處方飲片藥材打粉，蜂蜜調(diào)和，貼敷，臨床療效確切，深受患者認(rèn)可。筆者在本實(shí)驗(yàn)考察活血祛瘀巴布劑透皮性能，選擇君藥丹參中丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸以及丹酚酸B 5種主要有效成分為檢測(cè)指標(biāo)，考察其體外釋放度、離體透皮率及制備的巴布劑動(dòng)力學(xué)釋放行為，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ME215S電子分析天平(Sartorius公司，Max210 g，d=0.01 mg)；Essentia LC-16高效液相色譜儀(日本島津公司，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器：SPD-20A)；RYJ-6A型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器廠)；超純水機(jī)(上?；莘挚茖W(xué)分析儀器有限公司)；KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量(20±5)g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.4200695787，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2019-0030。屏蔽環(huán)境飼養(yǎng)，普通維持飼料，自由飲水。室溫(22±3) ℃，相對(duì)濕度(55±5)%，12 h光照黑暗循環(huán)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，采用梯度洗脫方法，具體洗脫流程見(jiàn)表1；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm。

表1 梯度洗脫程序

2.2樣品的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品，置5個(gè)50 mL量瓶，70%甲醇溶解，制成丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B含量分別為0.108，0.1026，0.1248，0.1516，0.1646 mg·mL-1貯備液，精密量取上述5個(gè)對(duì)照品溶液5 mL，置50 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，即為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 按活血祛瘀巴布劑處方稱取藥材，加30%乙醇滲漉提取，所得藥液減壓濃縮成流浸膏，備用。稱取聚丙烯酸鈉，加甘油攪拌溶解，加入活血祛瘀巴布劑流浸膏，加入明膠膠體液溶脹，加入氮酮，攪拌熟化，攤涂。晾干，按規(guī)格切割成片，密封袋保存。

取活血祛瘀巴布劑一貼(批號(hào)：19081501)，除去蓋襯，取膏體約0.4 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶，密封，精密加入60%乙醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理15 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用60%乙醇補(bǔ)質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.2.3陰性溶液 按活血祛瘀巴布劑處方，稱取除丹參外的其他藥材，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，過(guò)濾，續(xù)濾液即為陰性溶液。

漢英學(xué)習(xí)型詞典形容詞條目譯義語(yǔ)境化描寫(xiě) ……………………………………………………… 秦 曦（5.34）

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性考察 按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別取混合對(duì)照品溶液(丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B對(duì)照品濃度分別為0.010 8，0.010 26，0.012 48，0.015 16，0.016 46 mg·mL-1)、供試品溶液、陰性溶液，分別進(jìn)樣10 μL檢測(cè)，得色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，供試品各指標(biāo)組分與對(duì)照品組分保持一致，同時(shí)組分間均可以實(shí)現(xiàn)很好分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于3000，陰性樣品無(wú)干擾。

1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.阿魏酸；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B。

2.3.2線性關(guān)系考察 分別取“2.2.1”項(xiàng)5個(gè)對(duì)照品貯備液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣1，2，4，8，10，20 μL，記錄峰面積，以進(jìn)樣含量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2，各組分在其范圍內(nèi)線性關(guān)系符合標(biāo)準(zhǔn)。

表2 各組分線性關(guān)系

2.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算得丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面積RSD分別為0.23%，0.72%，0.89%，1.04%，1.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取活血祛瘀巴布劑一貼(批號(hào)：19081501)，除去蓋襯，取膏體約0.4 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶，密封，精密加入60%乙醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理15 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，稱質(zhì)量，加60%乙醇補(bǔ)充質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣10 μL，計(jì)算6個(gè)時(shí)間點(diǎn)丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量，與0 h樣品含量進(jìn)行比較，計(jì)算得RSD<1%，說(shuō)明樣品24 h基本無(wú)降解； 5種組分峰面積RSD分別為1.27%，1.44%，0.96%，1.36%，1.75%，表明溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取活血祛瘀巴布劑(批號(hào)：19081501)，除去蓋襯，取6份膏體，每份約0.4 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算得丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量分別為212.39，132.532，373.04，408.044，554.42 μg，RSD分別為1.83%，1.90%，1.99%，1.48%，1.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 見(jiàn)表3。取活血祛瘀巴布劑(批號(hào)：19081501)，除去蓋襯，分別稱取6份膏體，每份約0.2 g，精密稱定，分別加入丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果RSD分別為1.17%(n=6)、1.28%(n=6)、1.02%(n=6)、0.38(n=6)、0.68%(n=6)，表明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好，數(shù)據(jù)可靠，方法可行。

表3 6種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4樣品含量測(cè)定 取活血祛瘀巴布劑3批(批號(hào)：19081501，19081502，19081503)，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.5釋放度實(shí)驗(yàn) 按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》(四部)項(xiàng)下通則0931關(guān)于溶出度與釋放度測(cè)定法第四法槳碟法進(jìn)行操作[1-2]：取不銹鋼篩網(wǎng)(孔徑2 mm×2 mm)制成2個(gè)網(wǎng)碟，精確稱取活血祛瘀巴布劑0.4 g，將其用2個(gè)網(wǎng)碟固定，同時(shí)使巴布劑藥面朝上，置于500 mL燒杯中部，加入37 ℃0.9%氯化鈉溶液500 mL，保持恒溫，用攪拌槳?jiǎng)蛩贁嚢?，分別于30，60，90，120，150，180 min精密吸取溶液100 mL，取樣后再分別注入37 ℃0.9%氯化鈉溶液100 mL。

2.5.1供試品溶液的制備 分別將6個(gè)時(shí)間段接收液分別置水浴鍋蒸干，用60%甲醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶，并定容至刻度、搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.5.2釋放度測(cè)定結(jié)果 將上述6個(gè)時(shí)間段制備的樣品溶液，按照上述“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算釋放含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 活血祛瘀巴布劑離體釋放度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6離體小鼠透皮率測(cè)定 取清潔級(jí)小鼠，脫頸處死，電動(dòng)剃刀將腹部脫毛，脫毛過(guò)程中不損害外部皮膚，酒精消毒，從腹部剪開(kāi)皮膚，0.9%氯化鈉溶液清洗[3-5]。采用改良Franz擴(kuò)散池，將腹部鼠皮朝下，腹部?jī)?nèi)皮層朝上，置于接收池上，稱取活血祛瘀巴布劑0.40 g，精密稱定，貼敷于老鼠皮部，將接收池內(nèi)加滿0.9%氯化鈉溶液，水浴恒溫保持(37±1)℃，開(kāi)啟磁力攪拌(攪拌速度200 r·min-1)，分別于1，2，4，8，12，24 h，取出接收池中接收液，同時(shí)補(bǔ)充同量恒溫0.9%氯化鈉溶液(37±1 ℃)。

2.6.1活血祛瘀巴布劑透皮供試品溶液的制備 分別將6個(gè)時(shí)間段的接收液置水浴鍋蒸干，60%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶，并定容至刻度、搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.6.2離體透皮率含量測(cè)定 將上述制備的樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件注入高效液相色譜儀，分別進(jìn)樣10 μL檢測(cè)，計(jì)算樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量及經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合，活血祛瘀巴布劑(0.400 0 g)中含有丹參素鈉212.923 μg、原兒茶醛132.532 μg、阿魏酸373.204 μg、迷迭香酸408.044 μg、丹酚酸B554.42 μg，結(jié)果見(jiàn)圖3和表5。

圖3 活血祛瘀巴布劑中丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B累積透皮量-時(shí)間變化曲線

2.7結(jié)果 由表5結(jié)果可知，活血祛瘀巴布劑中丹參素鈉經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程符合Higuchi方程，擬合度為0.934；原兒茶醛透皮動(dòng)力學(xué)擬合方程中，擬合度最高為0.943，符合Higuchi方程；阿魏酸經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程中，符合Higuchi方程，擬合度為0.973；迷迭香酸經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程中，符合Higuchi方程，擬合度為0.961；丹酚酸B動(dòng)力學(xué)擬合方程中，擬合度最高為0.975，符合Higuchi方程。

由圖5結(jié)果可知，活血祛瘀巴布劑中離體小鼠透皮率，5種有效組分含量均為逐步緩慢釋放，在皮膚角質(zhì)層進(jìn)行貯庫(kù)蓄積，從而進(jìn)行低速運(yùn)輸，表明該制劑為骨架型緩釋制劑[6-7]。

表5 經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程

3 討論

活血祛瘀巴布劑具有行氣活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效。本實(shí)驗(yàn)選擇丹參中水溶性有效成分丹參素鈉、原兒茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B進(jìn)行含量測(cè)定，考察指標(biāo)成分均對(duì)骨疾病有良好藥理功效，其中丹參素鈉具有抑制破骨細(xì)胞成熟和活化，減少骨組織吸收、破壞[8]，上皮分化因子通過(guò)骨保護(hù)素和核因子-κB活化受體配體調(diào)控破骨細(xì)胞；原兒茶醛能明顯改善模型動(dòng)物骨物理指標(biāo)，增加骨密度、骨礦物質(zhì)和有機(jī)質(zhì)，增強(qiáng)各重要器官質(zhì)量比(器官質(zhì)量/體質(zhì)量)，從而有效防治醋酸潑尼松所致骨質(zhì)疏松[9]；阿魏酸可以在骨折愈合初期血腫機(jī)化期，通過(guò)加快微循環(huán)血流速度，增加毛細(xì)血管網(wǎng)的通透性，改善骨折斷端局部血液循環(huán)，清除血凝塊及代謝產(chǎn)物，促進(jìn)骨折愈合[10]；迷迭香酸通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生細(xì)胞色素C，引起激活T細(xì)胞凋亡[11]；丹酚酸B可用于防治糖皮質(zhì)激素所致松質(zhì)骨骨量丟失，有效抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、礦化[12]。

對(duì)所考察的含量測(cè)定指標(biāo)成分，通過(guò)紫外分光光度儀進(jìn)行最佳波長(zhǎng)選擇，發(fā)現(xiàn)吸收波長(zhǎng)為287 nm時(shí)，各組分均有良好響應(yīng)吸收峰，故確定最佳吸收波長(zhǎng)為287 nm。選擇流動(dòng)相時(shí)，考察了甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%醋酸等不同流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，采用乙腈-0.1%磷酸時(shí)，峰形較好，采用該流動(dòng)相進(jìn)行梯度條件的篩選，最終確定最佳梯度洗脫流動(dòng)相。

筆者在本實(shí)驗(yàn)制備的巴布劑通過(guò)釋藥動(dòng)學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)該藥為骨架型透皮制劑，骨架型透皮吸收制劑是藥物分散在聚合物骨架中，由骨架的組成成分來(lái)控制藥物的釋放。骨架型透皮貼比貯庫(kù)型更薄更小，而且皮膚刺激性小，因此患者的順應(yīng)性更好，為目前藥物經(jīng)皮領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[13]。巴布劑中有效成分的釋放較為緩慢、平穩(wěn)，從而可有效地避免血藥濃度的明顯波動(dòng)，減少血藥濃度“峰谷”現(xiàn)象，減少患者因血藥濃度過(guò)高而發(fā)生的不良反應(yīng)。制備的活血祛瘀巴布劑緩控釋制劑可實(shí)現(xiàn)藥物釋放的定時(shí)、定位、定速，從而可使藥物發(fā)揮出更好的療效。