雪膽素甲對(duì)小鼠乳腺腫瘤的抑制作用及其機(jī)制*

吳璐璐，田瑜，龔令熙，黃光英

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038)

乳腺腫瘤是當(dāng)前全球女性發(fā)病率最高的腫瘤疾病，每年因罹患乳腺腫瘤死亡的婦女約52萬例，乳腺腫瘤高居女性惡性腫瘤死亡第一位[1]。2012年數(shù)據(jù)顯示，中國女性乳腺癌新發(fā)約19萬例，死亡近5萬例。雖然按統(tǒng)計(jì)中國乳腺癌發(fā)病率仍屬低發(fā)，但呈逐年上升趨勢[2]。目前，惡性乳腺腫瘤的治療尤其是三陰性乳腺腫瘤的治療方法進(jìn)展不多，以手術(shù)切除和放化療結(jié)合為主要治療手段?；瘜W(xué)治療(化療)常規(guī)藥物為蒽環(huán)類、抗代謝類、鉑類、紫杉類及內(nèi)分泌輔助藥物如他莫昔芬、托瑞米芬等[3]。上述治療藥物均存在靶向性差、全身性毒副作用明顯、癥狀改善能力有限等缺點(diǎn)。其他如分子靶向藥物曲妥珠單抗、利妥昔單抗等價(jià)格昂貴，普通患者難以承受。因此，開發(fā)高效、低毒和價(jià)廉的乳腺腫瘤治療藥物是新藥研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

近年來，中藥復(fù)方黃黛片等[4]治療腫瘤取得進(jìn)展。中藥雪膽(HemsleyachinensisCogn.ex Forbes et Hemsl.)為葫蘆科植物雪膽Hemsleyaamabilis Diels的干燥塊根，能清熱解毒、消炎殺菌[5]，臨床用于胃炎、胃潰瘍及呼吸道感染等的治療。近來研究發(fā)現(xiàn)，其三萜類成分雪膽素甲對(duì)非小細(xì)胞肺癌有一定抑制作用[6-7]。筆者在本實(shí)驗(yàn)觀察雪膽素甲(cucurbitacin α，CUBα)對(duì)乳腺腫瘤模型小鼠腫瘤的抑制作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試藥 CUBα，含量不低于90%(高效液相色譜法測定)，購于遼寧大連美侖化學(xué)試劑公司，批號(hào)：160325；橄欖油，購于西安天龍?jiān)噭┕荆?hào)：TA15060；二甲基苯蒽(methylnitrosourea，DMBA)，批號(hào)：089K073，純度≥95%，購于美國Sigma公司；他莫昔芬，奧地利Ebewe Pharma公司產(chǎn)品，批號(hào)：612487-72-6；10%水合氯醛，購于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，批號(hào)：20180516；無水乙醇，化學(xué)純，購于重慶浩康醫(yī)藥化工集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20161205。Na+-K+-ATP酶、 Ca2+-Mg2+-ATP 酶、超氧化物歧化酶(SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性檢測試劑盒，雌二醇和孕酮酶聯(lián)免疫試劑盒(均購自武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)分別為171020、170806、170628、171011、170906)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒購自南京建成生物技術(shù)公司，批號(hào)分別為20171218和20180115。

1.2儀器與設(shè)備 UV2000紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；全波長掃描酶標(biāo)儀(美國Thermo科技公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；飛鴿TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)(離心半徑8.76 cm，上海安亭科學(xué)儀器廠)；多功能小鼠活動(dòng)記錄儀(上海智尚醫(yī)學(xué)設(shè)備公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性Balb/c小鼠，無特定病原體(SPF)級(jí)，7～8周齡，體質(zhì)量(19.2±3.6) g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0002。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.4動(dòng)物的造模與處理 實(shí)驗(yàn)小鼠以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量采用配對(duì)設(shè)計(jì)隨機(jī)分組法分為6組，每組12只，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、他莫昔芬(陽性對(duì)照)組和CUBα小劑量組、中劑量組、大劑量組。模型對(duì)照組、他莫昔芬組(陽性對(duì)照組)和CUBα 小劑量、中劑量、大劑量組參照文獻(xiàn)[8]方法并改良，造模，每3 d給予15 mg·mL-1DMBA橄欖油溶液 8 μL皮下注射，連續(xù)8周，以手觸摸小鼠有腫瘤出現(xiàn)為止；他莫昔芬組造模開始時(shí)按5 mg·kg-1·d-1灌胃給予他莫昔芬混懸液(0.9%氯化鈉溶液混懸，0.2 mg·mL-1)；CUBα各劑量組按12.5，25，50 mg·kg-1·d-1灌胃給予 CUBα混懸液(0.2%聚山梨酯-羧甲基纖維素鈉混懸，30 mg·mL-1)；空白對(duì)照組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液；停止DMBA后繼續(xù)給藥16周，迅速斷頭處死(為避免麻醉藥對(duì)檢測指標(biāo)影響)，取血液，剝離臟器及腫瘤組織，血漿置-80 ℃保存?zhèn)溆?。組織除需立即檢測外，其他以4%甲醛固定備用。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠均給予普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.5檢測指標(biāo)

1.5.1一般狀況、雌二醇和孕酮水平 造模開始后，每周觀察小鼠狀態(tài)，測量體質(zhì)量和直腸溫度；監(jiān)測小鼠 10 min內(nèi)自主活動(dòng)次數(shù)；實(shí)驗(yàn)開始后第8，16，24周，經(jīng)眼眶采血0.5 mL，加入有乙二胺四乙酸二鈉的無菌離心管，顛倒離心管混勻，4 ℃靜置30 min，3000 r·min-1離心10 min，取上清液于新離心管，按試劑盒說明書檢測雌二醇和孕酮水平。

1.5.2瘤體和免疫臟器質(zhì)量檢測 處死小鼠，分離并測定脾臟、胸腺質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。抑瘤率(%)=(模型對(duì)照組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量)/模型對(duì)照組瘤質(zhì)量×100%；臟器指數(shù)=胸腺(脾)質(zhì)量/(體質(zhì)量×100)。

1.5.3免疫指標(biāo)檢測 末次給藥24 h后經(jīng)尾靜脈取血，立即送檢白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)；小鼠斷頭所取血漿(乙二胺四乙酸二鈉抗凝)，1200 r·min-1離心5 min，按試劑盒說明書，ELISA法檢測TNF-α和IL-6水平。

1.5.4酶活性檢測 小鼠瘤體和組織以預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液洗凈、剪碎，制成10%勻漿液，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書標(biāo)示法測定組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶、SOD酶、GSH-Px酶活性，其中膜蛋白以小牛血清白蛋白為參比，采用 Lowry 法測定。

1.5.5腫瘤肺轉(zhuǎn)移觀察 參照文獻(xiàn)[9]方法，取小鼠肺組織，冰冷0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，Bouin液固定過夜，無水乙醇浸泡至顏色恢復(fù)。顯微鏡觀察計(jì)算白色肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。結(jié)節(jié)總數(shù)(個(gè)) =Ⅰ×1+Ⅱ ×2+Ⅲ×3+ Ⅳ×4，按結(jié)節(jié)直徑分為四級(jí)：Ⅰ級(jí)<0.5 mm，0.5 mm≤Ⅱ級(jí)<1 mm，1 mm≤Ⅲ級(jí)≤2 mm，Ⅳ級(jí)>2 mm。

2 結(jié)果

2.1對(duì)小鼠體質(zhì)量和體溫的影響 開始造模14周后，模型對(duì)照組、CUBα小劑量組體溫明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)(圖1A)，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增長明顯低于空白對(duì)照組。他莫昔芬組小鼠體質(zhì)量增長最緩慢(圖1B)。

A.體溫；B.體質(zhì)量。

2.2對(duì)腫瘤生長進(jìn)展的影響 結(jié)果見表1。造模后16周，空白對(duì)照組小鼠未見腫瘤生長；模型對(duì)照組小鼠瘤體生長明顯，腫瘤發(fā)生率100%，平均瘤體質(zhì)量(4.72±1.02) g；單因素方差分析結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，給予他莫昔芬(5 mg·kg-1)和中、大劑量CUBα后，瘤體質(zhì)量均明顯減小(P<0.05)。與他莫昔芬組比較，CUBα中劑量組、大劑量組瘤體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3對(duì)血清性激素的影響 結(jié)果見表2。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后8周、16周和24周血清雌二醇和孕酮水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，他莫昔芬組小鼠雌二醇(16周、24周)和孕酮(8周、16周和24周)血清水平均顯著降低(P<0.05)。給予不同劑量CUBα后，小鼠血清雌二醇和孕酮水平較模型對(duì)照組低，高于他莫昔芬組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4對(duì)白細(xì)胞和免疫器官的影響 結(jié)果見表3。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組WBC和脾臟、胸腺臟器指數(shù)均有所增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予他莫昔芬后，荷瘤小鼠WBC降至(9.75±1.22)×109·L-1，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別減少到(5.97±1.04)和(1.91±0.95) mg·g-1，均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.01)。給予小劑量、中劑量、大劑量CUBα處理的小鼠，其WBC、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與模型對(duì)照組比較，均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但明顯高于他莫昔芬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組小鼠瘤體質(zhì)量與抑瘤率測定結(jié)果

表2 6組小鼠激素水平測定結(jié)果

Tab.2 Determination results of the hormonal level in six groups of mice

表2 6組小鼠激素水平測定結(jié)果

組別雌二醇8周16周24周孕酮8周16周24周空白對(duì)照組157.7±12.9112.8±20.877.9±9.232.8±8.127.7±5.021.4±6.5模型對(duì)照組218.2±24.1①203.5±15.8①188.2±19.2①43.5±6.4①38.6±9.5①33.5±7.3①他莫昔芬組205.1±11.4141.9±8.5②85.9±6.0②37.1±4.6②31.3±5.1②25.3±3.5②CUBα 小劑量組 228.2±19.1182.8±20.2168.5±15.942.9±8.736.2±5.630.8±7.2 中劑量組198.0±14.7193.9±22.4170.6±17.641.9±7.635.0±6.329.3±2.6 大劑量組187.8±10.6183.3±19.2167.3±24.640.8±10.234.8±5.329.4±3.2

①與空白對(duì)照組比較，t=2.865～5.665，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=3.536～12.997，P<0.05。

①Compared with blank control group，t=2.865-5.665，P<0.05；②Compared with model control group，t=3.536-12.997，P<0.05.

表3 6組小鼠WBC與免疫器官臟器指數(shù)測定結(jié)果

2.5對(duì)免疫相關(guān)生化指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血漿TNF-α和IL-6均明顯增高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，他莫昔芬組TNF-α降低21.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-6水平降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較，CUBα各劑量組TNF-α和IL-6水平下降并呈劑量相關(guān)性。CUBα中劑量、大劑量組TNF-α與IL-6均明顯低于他莫昔芬組(均P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，CUBα大劑量組IL-6水平更高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2。

2.6對(duì)腫瘤相關(guān)酶活性指標(biāo)的影響 結(jié)果見表3。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶、SOD酶和GSH-Px酶活性均明顯下降(P<0.05)。加入他莫昔芬或不同劑量CUBα處理后，酶活性均有所恢復(fù)但均低于空白對(duì)照組，其中大劑量CUBα組小鼠Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶和GSH-Px與空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SOD活性水平仍明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)。與他莫昔芬組比較，大劑量CUBα對(duì)Ca2+- Mg2+-ATP 酶活性的保護(hù)作用更強(qiáng)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Na+-K+-ATP酶、SOD酶和GSH-Px酶活性方面小劑量、中劑量CUBα組與他莫昔芬組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)荷瘤小組Na+-K+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶、SOD酶和GSH-Px酶活性的保護(hù)作用，小劑量組、中劑量組、大劑量組呈劑量相關(guān)性，且大劑量組具有更強(qiáng)的酶活性保護(hù)作用。

①與空白對(duì)照組比較，t=3.275，6.492，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=2.740，P<0.05；③與他莫昔芬組比較，t=2.807～7.338，P<0.05。

①與空白對(duì)照組比較，t=2.935 2～6.239 0，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=2.174 3～5.412 0，P<0.05；③與他莫昔芬組比較，t=2.589 0～4.181 6，P<0.05。

2.7對(duì)腫瘤肺轉(zhuǎn)移的影響 結(jié)果見表4?？瞻讓?duì)照組小鼠未見肺結(jié)節(jié)。他莫昔芬組平均結(jié)節(jié)數(shù)較模型對(duì)照組多2.6個(gè)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給予不同劑量CUBα后，小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均有所降低，且劑量越大，小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)越少。其中，CUBα中劑量組、大劑量組與空白對(duì)照組和他莫昔芬組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 6組小鼠乳腺腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

DMBA誘導(dǎo)Balb/c小鼠建立乳腺腫瘤模型，屬較成熟的誘發(fā)性乳腺腫瘤模型，其腫瘤模型的形態(tài)學(xué)特性、內(nèi)分泌影響和侵襲性特點(diǎn)與人類乳腺腫瘤相似，已廣泛用于腫瘤的病理生理及藥物分子機(jī)制等研究[10-11]。然而，不同動(dòng)物對(duì)DMBA誘導(dǎo)乳腺癌的敏感性差異較大，發(fā)病率也不一致[12]。筆者在本研究采用改進(jìn)劑量和給藥方式造模，給藥后8周小鼠出現(xiàn)明顯腫瘤體征，且激素水平、免疫器官及功能、腫瘤相關(guān)酶指標(biāo)變化以及在他莫昔芬作用下的應(yīng)答均與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示本研究建立的乳腺腫瘤小鼠模型可用于腫瘤藥物治療相關(guān)研究[8～11]。

CUBα是從葫蘆科雪膽屬塊莖中分離出的有效成分之一，既往研究[13]表明CUBα可通過破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架而抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13-15]，從而阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組小鼠在造模過程中逐漸出現(xiàn)自主活動(dòng)明顯減少，踡縮少動(dòng)、弓背毛松、畏寒喜暖、莫名寒戰(zhàn)等現(xiàn)象，造模14周后，模型對(duì)照組、CUBα 小劑量組體溫和體質(zhì)量增長明顯低于空白對(duì)照組，模型對(duì)照組腫瘤增長迅速，腫瘤發(fā)生率100%。陽性藥物他莫昔芬治療后，瘤體生長明顯降低，CUBα中劑量組、大劑量組瘤體質(zhì)量較模型對(duì)照組明顯降低，但較他莫昔芬組抑制程度略低，且CUBα小劑量組、中劑量組、大劑量組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均低于模型對(duì)照組和他莫昔芬組，表明CUBα能改善模型小鼠腫瘤體征，抑制腫瘤生長，阻止腫瘤進(jìn)展。

研究認(rèn)為有絲分裂激酶Aurora A的抑制劑有明顯的抗乳腺腫瘤效果，尤其是在雌激素受體陽性乳腺腫瘤細(xì)胞中，能逆轉(zhuǎn)乳腺腫瘤細(xì)胞的耐藥性，提高對(duì)內(nèi)分泌治療應(yīng)答的的敏感性[10]。而近來對(duì)CUBα的研究[6]發(fā)現(xiàn)，其抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的機(jī)制，很可能與其抑制Aurora A 磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期有關(guān)，提示CUBα作為潛在的Aurora A酶抑制劑，可能對(duì)乳腺腫瘤具有抑制作用。

乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，其發(fā)病與遺傳、內(nèi)分泌和環(huán)境等多種因素有關(guān)，尤其與性激素密切相關(guān)。徐紅等[16]研究認(rèn)為血清中雌激素、孕激素水平增高可能是致乳腺纖維腺瘤、乳腺癌的直接原因。他莫昔芬是首個(gè)上市的抗雌激素受體的腫瘤內(nèi)分泌治療藥物，用于乳腺癌、卵巢癌等腫瘤治療及預(yù)防等[17]。他莫昔芬可與雌激素受體競爭結(jié)合，形成受體復(fù)合體，從而阻止雌激素發(fā)揮作用，以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖或減少腫瘤發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 相較于模型對(duì)照組，給予他莫昔芬后，雌二醇和孕酮水平均明顯降低，而給予CUBα雖能降低雌二醇和孕酮水平，但3個(gè)劑量組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CUBα對(duì)腫瘤作用的機(jī)制可能與他莫昔芬不同。

在腫瘤的發(fā)生過程中，核因子κB ( nuclear factor，NF-κB)和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducersand activators of transcription 3，STAT3) 可能是調(diào)控腫瘤炎性微環(huán)境核心分子，并在多種腫瘤中檢測到NF-κB和STAT3的共激活[18]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1、TNF-α等炎癥因子可通過上調(diào)NF-кB活性促進(jìn) IL-6分泌，間接活化STAT3，從而通過介導(dǎo)炎癥遞質(zhì)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤發(fā)生及腫瘤相關(guān)性炎癥的形成[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于模型對(duì)照組，小鼠給予不同劑量CUBα后，TNF-α和IL-6水平均下降并呈療效相關(guān)性，中劑量和大劑量CUBα組TNF-α和IL-6均明顯低于他莫昔芬組，提示CUBα可能參與抑制炎癥相關(guān)因子的形成，抑制腫瘤炎癥微環(huán)境進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給予不同劑量CUBα后，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性水平明顯提高，并具療效關(guān)系，可能與其具有較強(qiáng)的保護(hù)細(xì)胞膜、改善細(xì)胞穩(wěn)定性作用有關(guān)。

在本研究的12.5～50 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)，CUBα能改善模型小鼠腫瘤體征，抑制腫瘤生長，降低雌二醇和孕酮水平，保護(hù)SOD、GSH-Px酶活性及減少肺轉(zhuǎn)移。尤其在對(duì)改善白細(xì)胞計(jì)數(shù)及脾、胸腺指數(shù)、TNF-α和IL-6水平等免疫相關(guān)指標(biāo)的影響上，作用明顯且具較明顯的量效關(guān)系，提示CUBα對(duì)DMBA小鼠腫瘤的抑制作用可能與其保護(hù)抗炎[5]、保護(hù)免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)免疫功能有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CUBα劑量相關(guān)性提升血液紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性水平，并且中劑量、大劑量效果明顯強(qiáng)于5 mg·kg-1他莫昔芬，提示CUBα對(duì)腫瘤作用的機(jī)制與他莫昔芬不同，可能與其具有較強(qiáng)的保護(hù)細(xì)胞膜、改善細(xì)胞穩(wěn)定性作用有關(guān)，但該現(xiàn)象是否與其調(diào)節(jié)免疫進(jìn)而抑制腫瘤的藥理作用關(guān)聯(lián)，以及其分子機(jī)制如何，尚待進(jìn)一步研究。