“甘草-馬錢子”配伍前后及其拆分相態(tài)指紋圖譜對比研究

郭玉巖，李春成，孫爽，楊大宇，呂邵娃

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥配伍減毒是中醫(yī)藥學(xué)的特色和優(yōu)勢之一，有毒中藥通過與其它藥物配伍，不僅可以增強(qiáng)藥力、提高療效，同時(shí)又可減輕或消除毒副作用。馬錢子為典型的有毒中藥，其因止痛作用較為明顯[1]，為歷代醫(yī)家所推崇，與甘草配伍為其常見的減毒方法[2]，古籍有記“生馬錢子加甘草浸泡”“服馬錢子量大時(shí)，飲甘草水解之”“馬錢子內(nèi)服方劑與甘草配伍”或“甘草炙馬錢子”等，現(xiàn)代含有馬錢子的舒筋丸、疏風(fēng)定痛丸等口服制劑處方也均見與甘草配伍使用，足見甘草能緩和馬錢子的毒性。目前已有不少學(xué)者關(guān)注了甘草配伍馬錢子減毒的這一現(xiàn)象，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘草和馬錢子在水煎煮過程中生成了大量沉淀，推測煎煮過程中溶入水體的次生代謝小分子成分、生物大分子物質(zhì)以及無機(jī)元素等均影響和改變著湯液的理化性質(zhì)，這些天然的表面活性劑，可起到助懸、絮凝和反絮凝等多種作用，使得湯液成為真溶液、膠體溶液和混懸液及大分子沉淀顆粒同時(shí)存在的復(fù)雜分散相態(tài)；進(jìn)一步對各相態(tài)中的毒效物質(zhì)含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，沉積物相態(tài)富集了近80%的毒效物[3]。然而甘草與馬錢子配伍前后是否有化學(xué)成分的改變，不同產(chǎn)地、批次藥材配伍后化學(xué)成分的監(jiān)控，以及甘草-馬錢子配伍拆分相態(tài)、化學(xué)成分的迥異均仍有待進(jìn)一步研究。

指紋圖譜技術(shù)是能夠標(biāo)示中藥化學(xué)成分特征的經(jīng)典技術(shù)，其既可以對已知成分進(jìn)行分析，也可以對未知成分進(jìn)行分析[4]，可較為全面地反映混合的復(fù)雜體系中各種化學(xué)成分及其含量情況[5]，為此，本文采用指紋圖譜技術(shù)，對甘草-馬錢子藥對配伍前后及其拆分相態(tài)的化學(xué)成分進(jìn)行特征分析，以期為甘草馬錢子的配伍應(yīng)用提供檢測手段，并為甘草解馬錢子之毒的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UItiMate3000色譜儀(美國Thermo Fisher Scienti-fic公司)；AB265-S分析電子天平(美國METTLER-TOLEDO公司)；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料

馬錢子、甘草藥材購自于北京同仁堂哈爾濱藥店有限責(zé)任公司；馬錢子堿(Y16A7S13272)、士的寧(Z02A7S18869)均購自上海源葉生物科技有限公司；甘草苷(HL04223898)、甘草素(HL042236198)、甘草酸(HI042238196)、異甘草素(HL042236198)、甘草查爾酮A(HL042237198)、甘草次酸(HL042902198)、異甘草苷(HI042234198)、芒柄花素(HL042235198) 均購自寶雞市晨光科技有限公司，甲醇、乙腈、冰醋酸、濃鹽酸、 三乙胺、磷酸等均為分析純級試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm 5 μm)色譜柱；以乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～10 min，5%～10% A；10～20 min，10%～13% A；20～30 min，13%～15% A；30～40 min，15%～20%A；40～45 min，20%～23%A，45～60 min，23%～32%A，60～80 min，32%～38%A；80～90 min，38%～48%A；90～105 min，48%～65%A；100～115 min，80%A)；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取士的寧、馬錢子堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，使?jié)舛确謩e0.205、0.215 mg/mL。另取甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草查爾酮A、異甘草素、甘草次酸、芒柄花素對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，制成濃度分別為0.189、0.198、0.250、0.216、0.202、0.246、0.217 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 甘草、馬錢子及甘草-馬錢子配伍供試品溶液的制備

分別稱取0.75 g甘草，0.25 g馬錢子，0.75 g甘草與0.25 g馬錢子的混合粉末，分別置于25 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)適量，超聲處理45 min，放冷，用鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)補(bǔ)足至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即分別為甘草、馬錢子及二者配伍供試品溶液。

2.3.2 甘草-馬錢子配伍相態(tài)供試品溶液的制備

按文獻(xiàn)進(jìn)行湯液相態(tài)拆分：精密移取馬錢子甘草共煎液，采用低溫沉降，高速離心以及生物膜透析的方法將湯液拆分成馬錢子甘草共煎液沉積物組、混懸物組、膠體液分、溶液組4個(gè)相態(tài)部分[6]。所有樣品真空冷凍干燥24 h，取出備用。

拆分相態(tài)供試品溶液的制備：分別取馬錢子甘草湯液相態(tài)凍干粉約1 g,加鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)適量，超聲處理45 min，放冷，用鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)補(bǔ)足至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得甘草-馬錢子相態(tài)的供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取甘草-馬錢子配伍供試品，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下的的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別以甘草酸的色譜峰為參照峰(S)，測定并計(jì)算得到共有峰相對保留時(shí)間RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取甘草-馬錢子配伍供試品，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下的的色譜條件，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣測定以甘草酸為參照峰(S)，測定并計(jì)算得到共有峰相對保留時(shí)間RSD<2%，表明穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取甘草-馬錢子配伍供試品，按“2.3”項(xiàng)下的方法分別平行制備6份供試品溶液，按“2.1” 項(xiàng)下的的色譜條件進(jìn)樣6次，以甘草酸的色譜峰為參照峰(S)，測定并計(jì)算得到共有峰相對保留時(shí)間RSD<2%，表明重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜及相似性評價(jià)

按“2.3”項(xiàng)下的方法，分別制備甘草、馬錢子，甘草-馬錢子配伍供試品溶液及四種相態(tài)拆分樣品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并記錄UPLC 色譜圖。將甘草-馬錢子配伍供試品溶液色譜圖cdf文件導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012版)”中，然后進(jìn)行譜峰匹配， 通過與對照品比對，共確定25個(gè)共有峰。指認(rèn)出9個(gè)成分。結(jié)果見圖1、圖2，表1、表2。通過比較甘草-馬錢子配伍供試品溶及混合對照品的圖譜，對合煎液中各共有峰進(jìn)行初步歸屬，1～5峰歸屬于馬錢子，6～25峰歸屬于甘草。通過保留時(shí)間和 UV 光譜的對照，確定色譜峰4，5，8，11，12，16，18，23，25，分別對應(yīng)馬錢子堿、士的寧、甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A、甘草次酸9個(gè)指標(biāo)性成分;分別計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間RSD為0.31%～2.80%。不同樣品各共有峰的峰面積相差較大，表明不同產(chǎn)地甘草與馬錢子的化學(xué)成分含量存在一定的差異。配伍后色譜與對照圖譜的相似度均在0.900以上，說明樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度較高，符合指紋圖譜的要求。

2.6 配伍前后指紋圖譜對比分析

通過對馬錢子、甘草單煎及其配伍前后指紋圖譜對比分析，鑒定結(jié)果顯示，經(jīng)過配伍后，經(jīng)過配伍后，沒有新峰出現(xiàn)，沒有出現(xiàn)差異峰，而經(jīng)配伍后士的寧與甘草酸的峰面積顯著減少，推測甘草-馬錢子配伍后減毒可能因?yàn)槲锢碜兓Y(jié)果見圖3。

2.7 不同相態(tài)指紋圖譜對比分析

以9種指標(biāo)性成分對馬錢子甘草配伍拆分后的四種相態(tài)色譜圖進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，甘草-馬錢子配伍后的活性成分大多數(shù)集中在沉積物相態(tài)中，在四種相態(tài)中，均有4、5、8、11號峰，分別為馬錢子堿、士的寧、甘草苷、異甘草苷。均檢是馬錢子-甘草配伍相態(tài)溶液中的特征性成分。其中D相態(tài)中包含所有指認(rèn)峰，A、B相態(tài)均有4、5、8、11、16、18，分別為馬錢子堿、士的寧、甘草苷、異甘草苷、異甘草素、甘草酸。C相態(tài)中指標(biāo)性成分最少。

注：4.馬錢子堿;5.士的寧;8.甘草苷;11.異甘草苷;12.甘草酸;17.甘草素;19.異甘草素;22.甘草查爾酮A;24.甘草次酸。圖1 馬錢子甘草配伍樣品UPLC圖譜

圖2 馬錢子甘草配伍樣品UPLC疊加圖譜

注：A.馬錢子供試品;B.甘草供試品;C.馬錢子-甘草配伍供試品。圖3 馬錢子-甘草配伍前后指紋圖譜對比UPLC色譜圖

表1 馬錢子-甘草配伍樣品共有峰的相對保留時(shí)間及相似度

表2 馬錢子-甘草配伍樣品共有峰的相對峰面積

注:A.混懸相態(tài);B.膠體相態(tài);C.溶液相態(tài);D.沉淀相態(tài)。圖4 馬錢子-甘草配伍四種相態(tài)的UPLC色譜圖

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

考察以水、甲醇-水(1∶1)、鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)為溶劑對馬錢子、甘草單煎液、馬錢子-甘草配伍液的指紋圖譜的影響[7]。結(jié)果表明，以鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)為溶劑，超聲提取提取所得的色譜峰信息量相當(dāng)，綜合考慮溶劑提取能力、色譜結(jié)果的準(zhǔn)確性，確定以鹽酸-甲醇-水(1∶50∶50)為超聲提取制備供試品。

3.2 流動(dòng)相的選擇

分別考察乙腈-1%乙酸、乙腈-0.2%乙酸-0.2%三乙胺、乙腈-0.2%乙酸、乙腈-甲酸水(pH=2.4)及乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，并不斷調(diào)整流動(dòng)相的比例來確定甘草-馬錢子最佳色譜條件[8]。結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，在選定的條件下，峰信息量較多，各色譜峰的分離效果較好，峰形優(yōu)良。

3.3 馬錢子-甘草指紋圖譜的建立

甘草-馬錢子是經(jīng)典的苦甘藥對，甘草對馬錢子減毒增效作用顯著，是臨床上常見配伍藥對。目前已有金永新等對烏拉爾甘草進(jìn)行高效液相指紋圖譜的研究[9]。王月輝、喬菲等[10-11]等采用HPLC進(jìn)行了馬錢子指紋圖譜的研究，建立了指紋圖譜，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，由于毒性限制，馬錢子在臨床中很少單獨(dú)使用，上述研究立足于甘草與馬錢子單獨(dú)的指紋圖譜研究，卻忽略了甘草與馬錢子配伍前后化學(xué)成分的變化和復(fù)方中各個(gè)成分間作用的“復(fù)雜性”“整體性”，難以較好詮釋兩者配伍“毒解而效不減的作用機(jī)制。本研究建立馬錢子-甘草配伍后的指紋圖譜方法，指認(rèn)了9個(gè)共有峰，相似度評價(jià)結(jié)果顯示，該結(jié)直觀、可靠、可操作性強(qiáng)，可為甘草和馬錢子的配伍應(yīng)用提供質(zhì)量研究方法。

3.4 馬錢子-甘草配伍前后化學(xué)成分的改變

中藥復(fù)方煎煮過程中常伴隨一系列復(fù)雜的物理、化學(xué)反應(yīng)，通過對關(guān)鍵藥對的分析，可深入挖掘中藥復(fù)方配伍規(guī)律，化學(xué)成分是藥對產(chǎn)生療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此可以從藥對配伍前后的化學(xué)成分變化著手探究配伍基礎(chǔ)。由于現(xiàn)階段多數(shù)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，指紋圖譜可更全面反應(yīng)藥對所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，可進(jìn)一步闡明藥對配伍增效的物質(zhì)變化基礎(chǔ)，體現(xiàn)了配伍過程中化學(xué)成分的整體變化情況。本文在指紋圖譜方法的基礎(chǔ)上，對馬錢子-甘草配伍前后的色譜峰進(jìn)行對比研究，結(jié)果顯示與單煎液相比，配伍后的色譜峰個(gè)數(shù)并沒有明顯變化，沒有新峰出現(xiàn)；然而，配伍樣品的色譜峰可見士的寧與甘草酸的峰面積顯著降低，且本課題組對配伍湯液進(jìn)行拆分時(shí)發(fā)現(xiàn)，其有大量新生沉淀的產(chǎn)生，推測馬錢子和甘草合煎過程，可能存在分子絡(luò)合等物理反應(yīng)的發(fā)生而起到減毒增效的作用。

3.5 馬錢子-甘草配伍湯液相態(tài)的色譜圖對比分析

近年來，以相態(tài)角度對有毒中藥的研究已取得一定的成果，例如研究發(fā)現(xiàn)附子-甘草藥對配伍時(shí)，其合煎渾濁湯液靜置后出現(xiàn)大量沉積物[12]，又有研究者發(fā)現(xiàn)，部分藥對如黃芩-黃連合煎產(chǎn)生的沉淀影響藥物效應(yīng)等[13]。本課題組前期[3]將甘草-馬錢子進(jìn)行了相態(tài)拆分，獲得溶液相態(tài)、膠體相態(tài)、混懸相態(tài)和沉積物4個(gè)相態(tài)，并對毒效成分的相態(tài)分布進(jìn)行了研究，本文通過指紋圖譜方法對4個(gè)相態(tài)的成分進(jìn)行對比分析，結(jié)果表明沉積物相態(tài)為活性成分的聚集相態(tài)，該相態(tài)的進(jìn)一步深入解析，可為馬錢子甘草配伍減毒機(jī)制提供又一突破。