鹽脅迫下棉花根系的轉(zhuǎn)錄組分析及耐鹽基因篩選

熱依麥阿依·阿布都艾尼， 陳 靜， 陳 蕓， 馬劉峰

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院∥新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 喀什 844000)

土壤鹽漬化是一種全球范圍內(nèi)的生態(tài)環(huán)境問題. 在全世界范圍內(nèi)約有7%的土地和20%的耕地受到鹽漬化的威脅[1]. 鹽脅迫可以影響植物的種子萌發(fā)、生長、分化以及發(fā)育的各個(gè)階段[2]. 提高植物內(nèi)在耐鹽基因的表達(dá)量，是鹽漬化土地資源開發(fā)利用的有效方式之一.

棉花是我國尤其是新疆重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國棉花供應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用. 但在棉花生產(chǎn)過程中，經(jīng)常遭受來自于土壤的鹽堿脅迫作用，土壤鹽漬化一直是制約新疆的棉花質(zhì)量和產(chǎn)量的重要環(huán)境限制因子. 因此，通過挖掘和篩選棉花耐鹽相關(guān)基因，闡明它們在應(yīng)答鹽脅迫中的分子調(diào)控機(jī)制，并利用相關(guān)耐鹽基因資源進(jìn)行耐鹽棉花品種改良，為培育出對(duì)鹽脅迫耐受性更強(qiáng)的棉花新品種具有十分重要的意義.

目前，利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)進(jìn)行鹽脅迫相關(guān)基因篩選和挖掘已經(jīng)在多種植物中得到廣泛的應(yīng)用[3]，LIU等[4]對(duì)大豆葉片和根在鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)使碳代謝和氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，表明碳代謝和氮代謝參與了大豆對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答過程. PRIYANKA等[5]對(duì)在150 mmol/L NaCl處理?xiàng)l件下的葡萄葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)其碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、脂類代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的合成等代謝通路參與葡萄應(yīng)答鹽脅迫的過程. 陸地棉全基因組測序的完成也極大地推進(jìn)了棉花功能基因的篩選[6]. 目前為止，有關(guān)棉花的抗逆基因研究取得了較大的進(jìn)展，尤其是棉花耐鹽相關(guān)的分子生物學(xué)研究取得了很多成果，如LONG等[7]對(duì)亞洲棉、雷蒙德氏棉和陸地棉的NHX基因進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的比較研究，分別從這3種棉中鑒定了12、12和23個(gè)類NHX蛋白；基因結(jié)構(gòu)分析表明，NHX基因內(nèi)含子較多，可形成選擇性剪接，有利于植株適應(yīng)土壤高鹽環(huán)境，其中GhNHX1定位于棉株的液泡系統(tǒng)，受鹽脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo). GhNHX1的沉默增強(qiáng)了棉花幼苗對(duì)高鹽濃度的敏感性. 在轉(zhuǎn)基因棉花中過表達(dá)K2-NhaD，能提高棉花植株的耐鹽、耐旱性，增加脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，改善SOS途徑等代謝途徑[8]. 有關(guān)新疆主栽棉花品種的耐鹽基因篩選研究鮮有報(bào)道，本文以新疆主栽棉花品種為研究對(duì)象，以轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法為基礎(chǔ)，篩選新疆棉花中的耐鹽相關(guān)基因，為更深入地了解棉花的耐鹽分子機(jī)制及選育棉花耐鹽新品種提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以南疆地區(qū)主栽4個(gè)棉花品種(‘新陸中42號(hào)’、‘新陸中69號(hào)’、 ‘新陸中72號(hào)’及‘國審棉206-5’)為供試材料.

選取籽粒飽滿、大小一致的棉花種子，70%的酒精消毒1 min后，用30%的雙氧水浸泡1 h，再用無菌水沖洗3～5遍，無菌環(huán)境下放至種子萌發(fā)露白，在超凈工作臺(tái)上把露白的棉花種皮去掉，分別放入MS固體培養(yǎng)基和含0.50%NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，對(duì)照為不含NaCl的培養(yǎng)基. 每個(gè)培養(yǎng)基放3～4粒種子. 28 ℃培養(yǎng)，16 h光照/ 8 h黑暗，培養(yǎng)6 d.

1.2 棉花種子萌發(fā)期抗鹽性分析

將棉花種子分別在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50% NaCl)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，拍照并統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率.

1.3 總RNA提取

根據(jù)不同棉花品種的抗鹽性，對(duì)棉花培養(yǎng)6 d的‘新陸中69號(hào)’棉花根系，用天根公司植物多酚多糖RNA提取試劑盒提取總RNA，電泳檢測合格后，由上海派森諾公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析.

1.4 測序文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

選擇4個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，包含2個(gè)重復(fù)對(duì)照(CK1、CK2)和2個(gè)處理(NaCl1、NaCl2)，將待測序列樣品用Illumina Hiseq測序平臺(tái)上機(jī)測序之前把每個(gè)樣本的mRNA打斷成300 bp左右大小的片段，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后每個(gè)片段加上一個(gè)標(biāo)簽序列，就構(gòu)建成樣本文庫，文庫名按照CK1、CK2、NaCl1和NaCl2的順序分別命名為LRA01810、LRA01811、LRA01812和LRA01813. 待序列下機(jī)之后就可以按照文庫的標(biāo)簽序列區(qū)分不同的樣本列.

對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行CASAVA堿基識(shí)別分析，獲得測序數(shù)據(jù)序列信息，利用fastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量分析[9]，而后利用 NGSQC Toolkit去除低質(zhì)量堿基后得到Clean Reads[10]. 使用Hisat2軟件將Clean Reads比對(duì)到陸地棉基因組上，而后再使用Stringtie軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝[11]. 使用Htseq軟件對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)定量分析. Q20和Q30分別代表被99%和99.9%測準(zhǔn)確的堿基數(shù).N代表測序儀不能確切地測定出某一個(gè)堿基時(shí)的百分比(%)，測定不出的堿基就會(huì)標(biāo)注為N.

1.5 差異表達(dá)基因篩選及功能富集分析

采用R語言DESeq程序包對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)差異倍數(shù)|log 2(Fold Change)|>1 ，顯著性P<0.05[9]. 對(duì)得到的差異基因進(jìn)行GO注釋和KEGG通路分析.

1.6 基因表達(dá)檢測

利用上述方法提取‘新陸中69號(hào)’棉花根系RNA，5X All-In- One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購買自Applied Biological Materials (abm) Inc.)進(jìn)行cDNA合成. 根據(jù)已知的基因序列，設(shè)計(jì)RealTime PCR引物(表1)，按照TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex TaqTMII說明書進(jìn)行Real Time PCR. PCR反應(yīng)條件為：95 °C 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 °C 5 s，60 °C 34 s，共39個(gè)循環(huán). 利用2-ΔΔCT方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量.

表1 檢測基因表達(dá)的引物序列Table 1 The primer of gene expression detected

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花品種間的耐鹽性比較及耐鹽品種篩選

通過對(duì)4種棉花種子在不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)‘新陸中69號(hào)’棉花種子萌發(fā)最多(圖1A). 隨著處理的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，4種棉花種子的萌發(fā)率都下降，其中‘新陸中69號(hào)’棉花種子的萌發(fā)率最高(圖1B)，表明其具有較強(qiáng)的耐鹽性.

圖1 棉花品種間耐鹽性比較Figure 1 The comparison of salt tolerance among cotton varieties

2.2 鹽脅迫處理的棉花根系測序質(zhì)量分析

選擇經(jīng)0.50% NaCl處理的新陸中69號(hào)品種根系提取RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析. Illumina Hiseq平臺(tái)測序結(jié)果表明：CK1、CK2、NaCl1、NaCl2獲得的原始Reads分別是49 841 082、41 348 682、42 165 466、45 793 106條，去除接頭序列和低質(zhì)量堿基后，獲得的Reads分別是49 665 682、41 187 572、41 939 240和45 577 200條，且Q20和Q30分別達(dá)到97%和94%以上，說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高(表2).

表2 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)Table 2 The data filtering statistics

2.3 鹽脅迫下棉花根系差異表達(dá)基因分析

與對(duì)照材料相比(圖2)，經(jīng)過0.50% NaCl處理6 d后的棉花植株中有1 557個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化. 其中，在鹽脅迫條件下，有891個(gè)基因表達(dá)量增加，而666個(gè)基因表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào).

圖2 棉花根系差異表達(dá)基因的火山圖Figure 2 The volcano plot of differentially expressed genes in cotton roots

2.4 差異表達(dá)基因GO和KEGG注釋分析

對(duì)得到的棉花根系差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋分析(圖3A)，結(jié)果表明：在細(xì)胞組分分類中，差異基因共注釋到65個(gè)條目，其中注釋到最多的是細(xì)胞膜組分，共有173個(gè)基因；在分子功能分類中，差異基因共注釋到261個(gè)條目，其中共有162個(gè)基因功能注釋為氧化還原酶類，這說明氧化還原酶類基因在對(duì)于棉花應(yīng)答鹽脅迫是十分重要的；在生物學(xué)過程分類中，注釋到最多的是代謝進(jìn)程，共有440個(gè)基因，當(dāng)植物受到鹽脅迫后，會(huì)通過改變相應(yīng)的代謝進(jìn)程對(duì)鹽脅迫做出應(yīng)答，從而提高自身對(duì)鹽脅迫的抵御能力. 因此，參與植物各種代謝進(jìn)程的基因在植物應(yīng)答鹽脅迫過程中有著重要的意義.

KEGG分析的結(jié)果顯示：差異基因富集到20條代謝通路上，主要集中在木質(zhì)素生物合成途徑，該途徑在植物體的機(jī)械支持、水分運(yùn)輸以及抵抗各種不良環(huán)境影響中起著很重要的作用；其中，有64個(gè)差異基因富集到苯丙烷合成代謝途徑，是富集差異基因最多的代謝途徑. 此外，半乳糖代謝、胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝、鞘脂代謝、類黃酮生物合成、MAPK信號(hào)通路等代謝途徑也富集到較多的差異基因(圖3B)，說明這些代謝途徑可能在棉花應(yīng)答鹽脅迫過程中具有重要的作用.

圖3 棉花根系差異表達(dá)基因的GO和KEGG注釋分析Figure 3 The GO and KEGG pathway annotation analysis of differentially expressed genes in cotton roots

2.5 棉花響應(yīng)鹽脅迫期間差異基因表達(dá)變化

利用差異倍數(shù)大于2、校正后的P小于0.01進(jìn)行差異基因的篩選，選取對(duì)照和鹽脅迫條件下基因表達(dá)差異性最大的10個(gè)差異基因(表3)，分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)和基因功能注釋分析，結(jié)果表明：編號(hào)為Cot-AD 05721、Cot-AD 54195 和Cot-AD 47521的基因參與了ABA信號(hào)通路，其中，編號(hào)為Cot-AD 05721的基因?qū)儆诟缓腚装彼犷愂荏w激酶(CRK)基因家族，該基因家族編碼的蛋白是植物體內(nèi)普遍存在的一類蛋白激酶，是許多信號(hào)識(shí)別傳遞途徑中的關(guān)鍵組分，作為識(shí)別信號(hào)的質(zhì)膜受體，能夠感受外界刺激，通過磷酸化作用參與胞內(nèi)信號(hào)傳遞[12]；Cot-AD 54195基因編碼的蛋白主要參與調(diào)控環(huán)核苷酸離子通道(CNG)，在Ca2+響應(yīng)以及抗鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[13]；Cot-AD 47521基因編碼的蛋白是受體蛋白激酶家族中LRR型類受體蛋白激酶，能夠參與植物脅迫應(yīng)答過程[14]. Cot-AD 49287編碼角鯊烯環(huán)氧酶(SQE)，可催化鯊烯轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)氧化鯊烯. 擬南芥SQE1可參與調(diào)節(jié)根和種子萌發(fā)[15]. Cot-AD 56209可編碼硫氧還蛋白. Cot-AD 17346編碼的蛋白具有丙氨酰-tRNA合成酶活性. Cot-AD 50458編碼SPX1-like蛋白，AtSPX1在擬南芥葉片衰老中發(fā)揮重要作用[16]. Cot-AD 34390編碼的是ABCG家族基因，可參與對(duì)ABA轉(zhuǎn)運(yùn). Cot-AD 55296編碼AMSH-like泛素硫酯酶，擬南芥AMSH3參與泛素化膜蛋白的降解過程[17]. Cot-AD 59144編碼的是細(xì)胞色素P450家族基因，是一種末端加氧酶，可參與生物體內(nèi)甾醇類激素合成等過程.

表3 鹽脅迫下篩選的10個(gè)差異基因Table 3 The 10 DEGs screened under salt stress

利用qRT-PCR檢測棉花鹽脅迫處理后上述基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明：編號(hào)為Cot-AD 05721和Cot-AD 49287的基因上調(diào)表達(dá)；編號(hào)為Cot-AD 54195、Cot-AD 56209、Cot-AD 17346、Cot-AD 34390、 Cot-AD 50458、Cot-AD 55296、Cot-AD 59144和Cot-AD 47521的基因下調(diào)表達(dá). 10個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢均與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，統(tǒng)計(jì)相關(guān)性系數(shù)R2為0.923 4，具有良好的線性關(guān)系，說明轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量較高(圖4).

圖4 qRT-PCR檢測在棉花鹽脅迫時(shí)差異基因的表達(dá)Figure 4 The expression analysis of different genes detected by qRT-PCR

3 討論

當(dāng)植物受到鹽脅迫后，植物會(huì)通過調(diào)控耐鹽相關(guān)基因表達(dá)來應(yīng)對(duì)鹽脅迫的威脅. 植物的根部是決定整個(gè)植株生長發(fā)育的關(guān)鍵器官，由于根部直接接觸土壤中的鹽離子，也是接受鹽脅迫信號(hào)的最初位點(diǎn)，因此對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)也最為敏感、準(zhǔn)確[2，18]. 基于此，本文選擇棉花根部作為實(shí)驗(yàn)取材部位，旨在通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法從棉花根系中篩選出棉花耐鹽相關(guān)基因. 所備選的4個(gè)新疆主栽棉花品種中，‘新陸中69號(hào)’品種表現(xiàn)出較好的耐鹽性，適合作為轉(zhuǎn)錄組篩選耐鹽基因的實(shí)驗(yàn)材料. 通過將對(duì)照組和鹽脅迫處理組的棉花根系轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果從‘新陸中69號(hào)’中篩選到1 557個(gè)差異表達(dá)基因，其中有891個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)，666個(gè)基因表達(dá)量下調(diào). 有64個(gè)差異基因富集到苯丙烷類合成代謝途徑中，是富集差異基因最多的代謝途徑，這說明在棉花抵御鹽脅迫過程中，苯丙烷類合成代謝途徑發(fā)揮了重要的調(diào)控功能. 其他差異表達(dá)基因多集中在半乳糖代謝、胡蘿卜素生物合成、淀粉和蔗糖代謝等途徑.

通過qRT-PCR方法對(duì)棉花響應(yīng)鹽脅迫時(shí)差異性較大的10個(gè)基因表達(dá)分析的變化結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致. 其中，編號(hào)為Cot-AD 05721的基因?qū)儆贑RK家族基因，可參與細(xì)胞生物和非生物應(yīng)激反應(yīng). 擬南芥CRK2基因能提高種子萌發(fā)期幼苗的耐鹽性，并調(diào)節(jié)幼苗的根長.CRK2是鹽誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積所必需的關(guān)鍵基因，通過胼胝質(zhì)沉積對(duì)鹽分增加的響應(yīng)作用，證明CRK2基因在種子萌發(fā)過程中耐鹽性的重要性[19]. 本文中轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示：棉花在鹽脅迫后編號(hào)為Cot-AD 05721的基因表達(dá)量上調(diào)，推測該基因在棉花耐鹽脅迫應(yīng)答分子調(diào)控過程中發(fā)揮一定的作用. 編號(hào)為Cot-AD 54195的基因?qū)儆谡{(diào)控環(huán)核苷酸離子通道CNG家族基因，CNG家族在抗鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用. 編號(hào)為Cot-AD 47521的基因?qū)儆贚RR型受體蛋白激酶家族成員，JUNGA等[20]發(fā)現(xiàn)辣椒中LRR受體蛋白激酶基因CaLRR1的表達(dá)受高鹽的脅迫誘導(dǎo)，說明LRR可作為信號(hào)識(shí)別受體在多種信號(hào)途徑中起作用.

擬南芥植物中角鯊烯環(huán)氧化酶(SQE)可以環(huán)氧化角鯊烯為氧化三萜類化合物，在植物根和下胚軸伸長過程中發(fā)揮重要作用[15]. 本研究表明：編號(hào)為Cot-AD 49287的基因是一類編碼SQE的基因，該基因表達(dá)量顯著上調(diào)，表明其功能可能與棉花種子萌發(fā)期的根系伸長調(diào)控過程有密切關(guān)系. 編號(hào)為Cot-AD 56209的基因?qū)倏删幋a硫氧還蛋白，調(diào)控細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，而Cot-AD 17346編碼的蛋白則具有丙氨酰-tRNA合成酶活性. 目前，有關(guān)這2個(gè)基因在棉花根系發(fā)育和鹽脅迫中的調(diào)控過程如何發(fā)揮作用，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，作用機(jī)理尚不明確.

鹽漬環(huán)境下，植物根系的鹽分與營養(yǎng)元素之間產(chǎn)生協(xié)同或拮抗作用. 在鹽堿條件下，植物根系會(huì)降低對(duì)必需的大量營養(yǎng)元素磷的吸收能力，使磷的吸收和運(yùn)輸以及在體內(nèi)的分配遭到破壞, 導(dǎo)致營養(yǎng)失衡并加速植物葉片的衰老過程[21]. 擬南芥衰老葉片中存在顯著的磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)基因AtSPX1. AtSPX1是擬南芥葉片衰老、Pi饑餓和SA信號(hào)通路之間的關(guān)鍵調(diào)控因子[16]. 本文研究表明：Cot-AD 50458是一類編碼SPX1-like蛋白的因子，該基因表達(dá)量在鹽脅迫環(huán)境下表達(dá)量顯著下調(diào)，推測可能是在鹽脅迫的作用下抑制了棉花對(duì)磷元素的吸收功能，增加棉花葉片的衰老過程.ABCG家族基因，可參與植物對(duì)ABA的轉(zhuǎn)運(yùn)，其中ABCG25和ABCG40是高親和脫落酸(ABA)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白. ABCG14與細(xì)胞分裂素生物合成高度共表達(dá)，是根至芽的主要細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)運(yùn)體. 編號(hào)為Cot-AD 34390的基因?qū)儆贏BCG家族基因，推測Cot-AD 34390可能參與了棉花在鹽脅迫時(shí)期的ABA轉(zhuǎn)運(yùn)功能. Cot-AD 55296是一類可編碼AMSH-like泛素硫酯酶，KATSIARIMPA等[17]研究表明：擬南芥AMSH3基因調(diào)控泛素化膜蛋白的降解過程，泛素翻譯后修飾在調(diào)節(jié)內(nèi)吞降解過程中起關(guān)鍵作用；擬南芥AMSH3是一種去泛素酶，amsh3缺失突變體導(dǎo)致幼苗的致死率大幅提高，并在多種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中都表現(xiàn)出缺陷.

編號(hào)為Cot-AD 59144的基因是細(xì)胞色素P450家族基因，是一種末端加氧酶，可參與生物體內(nèi)甾醇類激素合成等過程. MAGWANGA等[22]研究表明：棉花CYP450基因在響應(yīng)植株干旱和鹽脅迫等逆境環(huán)境刺激過程中，發(fā)揮著重要的調(diào)控作用. 同樣，在擬南和水稻中，細(xì)胞色素P450蛋白家族可通過赤霉素失活在植物發(fā)育過程中發(fā)揮著靶特異性調(diào)控作用[23].PtCYP714A3在形成層-韌皮部組織中廣泛表達(dá)，且在楊樹中受鹽脅迫和滲透脅迫影響較大.PtCYP714A3異位表達(dá)導(dǎo)致水稻半矮化表型，分蘗促進(jìn)，籽粒變小[24]. 過量表達(dá)PtCYP714A3基因的轉(zhuǎn)基因株系較野生型植株，GA積累水平更低，部分GA生物合成基因的表達(dá)受到明顯抑制，表明PtCYP714A3在水稻幼苗對(duì)鹽毒反應(yīng)中起著重要的作用[23].

本研究對(duì)鹽脅迫下棉花根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，通過與正常培養(yǎng)條件下比較，初步篩選出的差異表達(dá)基因，通過qRT-PCR方法，對(duì)部分差異顯著的基因表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證. 后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)克隆這些經(jīng)過驗(yàn)證的完整cDNA序列，通過構(gòu)建過量表達(dá)載體，將基因轉(zhuǎn)化到擬南芥和棉花植株中進(jìn)行基因功能的遺傳學(xué)分析，其結(jié)果為進(jìn)一步克隆棉花關(guān)鍵抗鹽基因和認(rèn)識(shí)其功能提供了依據(jù)，也為揭示棉花的抗鹽機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

致謝 感謝華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李玲教授對(duì)本論文的指導(dǎo).