董允豪 金 月 崔成都 樸明淑*
(1、延邊大學 吉林省轉基因動物與胚胎工程重點實驗室,吉林 延吉133002 2、吉林省龍井市林業(yè)局草原管理站,吉林 龍井133400)
SOS 法是2010 年 Atwater等[1]學者開發(fā)的一種動物胰島分離方法,認為該方法與傳統(tǒng)的膠原酶法相比,有以下優(yōu)點具有常溫或低溫下進行、可保證胰島的完整性、價格低廉等優(yōu)點。2009 年Hilling 等[2]學者在進行人類和豬胰腺胰島分離過程中,發(fā)現收集到的胰腺中,近46%的胰腺呈充血狀態(tài),且這些處于充血狀態(tài)的胰腺在酶消化法分離的產量明顯下降,尤其在豬的胰腺分離過程中。因此,充血對動物胰腺胰島分離具有一定的影響。那么,充血在SOS 法分離胰腺胰島有何影響,未見報道。因此,本試驗以屠宰豬胰腺為試驗材料,采用SOS 法對充血和未充血狀態(tài)的胰腺進行胰島的分離提純試驗,為開發(fā)新的胰島分離提純方法的建立奠定基礎。
1.1.1 試驗材料本試驗取充血和非充血屠宰豬胰腺各5 例,均由延吉豬屠宰場提供。
1.1.2 主要試劑PBS 緩沖液、RPMI-1640 培養(yǎng)液、無水葡萄糖、Hanks、Histopaque-1077 胎牛血清、青鏈霉素、吖啶橙AO、溴化乙啶EB、DTZ、臺盼藍等。
1.1.3 主要儀器病理組織包埋機、石蠟切片機、攤片機、烘片機、超凈工作臺、電子天平、離心機、光學顯微鏡數碼圖像采集系統(tǒng)(BH-2) 、CO2 恒溫培養(yǎng)箱、體式顯微鏡、酶標儀、實體顯微鏡等。
圖1 屠宰豬胰腺HE×200 A:未充血胰腺;B:充血胰腺
1.2.1 胰腺的獲取、運輸及取材屠宰場放血致死后,剖腹迅速摘取胰腺放入含有雙抗的PBS 的保溫壺中,立即運回實驗室進行胰島分離(熱缺血時間控制在10 min 以內,冷缺血時間控制在30 min 以內。取部分胰腺組織放入10%福爾馬林固定用于石蠟切片制作。
1.2.2 豬胰腺的HE 染色取材固定,制作石蠟組織切片,HE染色,顯微鏡下觀察并照相。
1.2.3 基于SOS 法的豬胰島分離純化采用Enck K(2017)所介紹試驗方法,分別對充血和未充血胰腺,進行豬胰島的分離純化、并計算出胰島產量、純度、存活率及、的鑒定、計數及胰島素刺激指數(SI)。
1.2.4 統(tǒng)計分析本試驗數據均用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件分析,采用mean±SD 表示,P<0.05 具有差異顯著性,P<0.01 具有差異極顯著性。
圖2 屠宰豬胰島純化前、后DTZ 染色(×100)
光鏡下,未充血屠宰豬胰腺分為內分泌腺和外分泌腺,外分泌腺占胰腺的絕大部分。胰島發(fā)育較完全,胰島輪廓清晰,呈圓形或橢圓形,而充血屠宰豬胰腺外分泌腺和內分泌腺分界不清,組織間隙擴大,組織的嗜酸性增強,且大部分細胞出現核濃縮現象(如圖1)。
基于SOS 法分離的屠宰豬胰島被DTZ 染成猩紅色,多呈圓形或橢圓形,對胰島純化前后進行染色對比,純化前含有較多的胰島碎片和外分泌細胞碎片,純化后細胞碎片明顯減少,胰島純度提高。細胞壓片后胰島外ECM 保留完好(如圖2)。
在高糖濃度為500 mmol/L 下,采用SOS 法分別分離提純充血和未充血胰腺胰島。未充血胰腺平均產量為5840±625 個/g,純度為93.8±0.9%,刺激指數為1.93±0.18,存活率為95%(如表1)。
表1 SOS 法和膠原酶法分離提出胰島
基于SOS 法的胰島分離方法是分離胰島的一種新方法,與膠原酶灌注分離胰島相比,SOS 法具有在常溫或低溫下進行減緩細胞的凋亡速率、能保證胰島的完整性、分離過程中不產生對胰島有害的物質、價格低廉等優(yōu)點[1]。本試驗在未充血屠宰豬胰腺的SOS 法分離中獲得平均產量為5840±625 個/g、純度為93.8±0.9%、刺激指數為1.93±0.18、存活率為95%的較好的效果,且分離出的胰島形態(tài)均呈圓形或橢圓形,胰島表面光滑,符合胰島移植的形態(tài)學要求,但在充血胰島中未能分離出胰島,說明充血胰島不適用于SOS 法。因此,在今后的試驗中應注意分離提純前對試驗材料的篩選。
關于充血胰島,Hilling 等[2]學者在膠原酶法分離提純胰島的試驗研究中發(fā)現,充血的人類和豬胰腺中內分泌含量較高,且分離提純的胰島產量相比未充血胰島低,因此推測處死動物的某環(huán)節(jié)(如豬屠宰過程中的電擊等)導致動物的血壓升高,使胰腺充血所致。本試驗結果表明,未充血屠宰豬胰腺內、外分泌腺部界限清晰,外分泌腺占胰腺的絕大部分,胰島輪廓清晰,呈圓形或橢圓形,而充血屠宰豬胰腺外分泌腺和內分泌腺分界不清,組織間隙擴大,組織的嗜酸性增強,且大部分細胞出現核濃縮現象。充血胰腺的這種組織學變化特點,表明胰腺由于充血導致水腫,使組織間隙擴大,同時充血導致一些物質的分泌導致胰腺構成細胞的損傷。