兔急性骨骼肌損傷模型的建立及分期確定

吳安林，艾玨萍，謝秀惠，葉 平，楊 程，盧 園，陳海南，彭 亮

（湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南長沙，410208）

骨骼肌損傷為日常生活中最常見的損傷之一，其常發(fā)生于體育鍛煉及運動訓練中。骨骼肌損傷后不僅會產(chǎn)生強烈的疼痛、肌肉僵硬及攣縮，導致運動功能障礙及喪失，嚴重影響正常的工作、學習和生活，還會對人們的健康及生活品質(zhì)造成潛在的威脅。故充分研究骨骼肌損傷機制，觀察骨骼肌組織形態(tài)的病理變化過程顯得極其重要。在研究急性骨骼肌損傷過程中，動物實驗造模方法是實驗研究的首要環(huán)節(jié)，其直接影響到實驗結(jié)果的科學性。相關(guān)文獻顯示，急性骨骼肌損傷造模方法主要有重復性肌肉拉伸、電刺激、下坡跑、鈍性挫傷、銳性不橫斷切割及缺血再灌注等［1-6］，而重物打擊致傷（屬于鈍性挫傷）的造模方法最為常見，故本實驗改良了一種重物打擊造模方法進行急性骨骼肌損傷造模并對其進行相關(guān)觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑與儀器 常規(guī)化學試劑（上海國藥生物有限公司）、石蠟（Sigma）、中性樹膠（Sigma）、蘇木素（Wellbio）、PBS（7.2~7.6）（Wellbio）、伊紅（Wellbio）、多聚甲醛（Sigma）、搖床、恒溫箱、切片機、包埋機、顯微鏡。

1.1.2 實驗動物 健康清潔級新西蘭大白兔16只、3 個月月齡、雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供，分籠喂養(yǎng)、自由飲水、室溫控制在 20 ℃~25 ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法 采用并改進文獻［7-9］重力錘自由下落打擊造模方法進行造模，建立骨骼肌急性損傷模型。16 只新西蘭大白兔進行分籠適應性喂養(yǎng)7 d 后，隨機編號為1~16。為達到最接近人體皮膚的效果，對新西蘭兔進行剃毛處理，剃去兔右后肢濃厚的毛發(fā)。隨后抽取其中4 只進行擬造模，將實驗兔以腹面朝上捆綁于實驗臺，充分暴露其右后股四頭肌及相鄰部位肌肉，選取股四頭肌肌腹中段為打擊點，以其中點為圓心、直徑為1 cm進行畫圈標記，并于打擊部位覆蓋一層紗布以防局部皮膚受損；為保證重力錘下放速度及外力因素的一致性，由專人控制重力錘（質(zhì)量850 g，打擊頭為平滑木制圓柱，直徑1.5 cm）沿不銹鋼導向管（長30 cm，中空，直徑 1.8 cm）于高40 cm 處自由下落，同一部位連續(xù)進行6 次打擊，動能為3.33 J，沖量為2.38 N/s，打擊面積大約為1.77 cm2；為確保連續(xù)6 次不同打擊均能打擊在股四頭肌的同一位置，由專人用雙手拇食指固定兔股四頭肌上下端以防造模時因?qū)嶒炌脪暝斐纱驌酎c移位；以肉眼可見打擊部位皮膚出現(xiàn)明顯腫脹及瘀血，未見皮膚受損及骨折、觸碰時有躲避反射暫擬為造模成功。

1.2.2 實驗取材及處理 于實驗兔耳緣靜脈注入適當空氣將其進行處死后立即取材，對受傷局部骨骼肌組織進行取樣（大小約為8 mm×8 mm），4%多聚甲醛固定1 周，石蠟包埋，切片機切片及常規(guī)HE 染色后在光鏡下進行觀察：以可見肌纖維腫脹、變性，肌溶解以及局灶性壞死、肌纖維間水腫、炎癥細胞浸潤等骨骼肌組織形態(tài)學改變?yōu)樵炷３晒?。?shù)據(jù)結(jié)果顯示擬造模成功后，對剩余的12 只實驗兔如法進行造模，造模后每日喂食量、室溫等其他條件均與造模前完全保持一致。造模后每天分別于上午 9：30、下午 16：30 兩個時間點對實驗兔進行日常觀察，觀察其進食、活動、精神狀態(tài)、情緒及二便等情況；此外，分別于造模后第 1、3、5、7 天抽取 3 只實驗兔進行處死并取材，經(jīng)HE 染色等相關(guān)處理后在光鏡下進行形態(tài)學觀察。

2 結(jié) 果

2.1 日常行為學觀察

造模后第1、2 天：實驗兔精神狀態(tài)較差，蜷縮于兔籠角落，活動減少，懼人，部分實驗兔進食量較前稍減少，大小便情況較造模前無明顯變化；造模后第3、4 天：實驗兔精神狀態(tài)較前明顯好轉(zhuǎn)，活動量較前增加，進食量及大小便情況較造模前無明顯變化；造模后第5、6、7 天：實驗兔精神狀態(tài)恢復如常，活動量、進食及大小便等情況與造模前均無明顯差異。

2.2 形態(tài)學觀察

造模后不同時段形態(tài)學觀察量表見表1，光鏡下形態(tài)觀察圖見圖1。

圖1 造模后不同時段光鏡下形態(tài)學觀察圖

表1 造模后不同時段形態(tài)學觀察量表

造模后第1 天：可見肌間隙增寬，肌纖維腫脹，間質(zhì)水腫，肌細胞間可見大量血液滲出，炎癥細胞浸潤，部分肌纖維斷裂及細胞形態(tài)改變。造模后第3 天：大量炎癥細胞浸潤，肌細胞間可見大量紅細胞，可見纖維素樣物及空泡樣改變。造模后第5 天：細胞間隙較前明顯縮小，炎癥細胞浸潤較前減輕，間質(zhì)中可見大量成纖維細胞及毛細血管增生，肉芽組織增生，可見多核巨細胞。造模后第7 天：細胞間隙未見明顯水腫及出血，炎癥細胞數(shù)量較前明顯減少，大量肌纖維產(chǎn)生，瘢痕組織形成。

3 討 論

在已有的眾多造模實驗中，重力錘質(zhì)量、直徑以及下落高度均不同，且差距較大，故在進行正式造模前，本研究特意設置了“預造?！钡沫h(huán)節(jié)，在參考已有的造模相關(guān)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，設置了多組不同的重力錘質(zhì)量、直徑以及下落高度，經(jīng)過反復多次的造模及對實驗結(jié)果的仔細分析后得出最佳數(shù)據(jù)組以確保造模方法的可行性及準確性，并根據(jù)沖量及動能的大小對重力錘重量、下落高度及打擊次數(shù)進行了相應的改動以達到最佳的打擊造模效果。相對原造模方法，本研究在進行造模時采用了隔離模式進行造模，可防實驗兔在造模前受到驚嚇導致肌肉緊張而影響造模效果；在對實驗兔進行常規(guī)捆綁、精準定位及標記之外，還采用了專人雙手對實驗兔股四頭肌上下端進行雙重固定的方法，以確保多次打擊的作用點在同一位置，從而保證每次打擊的有效性及造模的精確性。打擊頭為平滑木制圓柱，可避免因打擊點不光滑而導致肌肉不均勻的創(chuàng)傷及出血；其直徑為1.5 cm，可避免因直徑太大而導致造模時打擊到股骨造成骨折，甚至打擊到股動脈而造成動脈破裂導致大出血。

通過光鏡下觀察，造模后第1 天可見肌纖維明顯腫脹及部分斷裂，出血及炎癥反應發(fā)生，為骨骼肌急性損傷之后典型的正常生理反應表現(xiàn)，說明骨骼肌急性損傷造模成功；結(jié)合行為學觀察，其精神狀態(tài)及活動量均明顯下降，符合實驗兔骨骼肌急性損傷后表現(xiàn)特點。第3 天炎癥反應進一步升級，可見大量炎癥細胞浸潤，纖維素樣物的產(chǎn)生及空泡樣改變說明肌細胞存在變性、壞死與崩解，此階段符合急性炎癥期的形態(tài)學改變，行為學觀察顯示實驗兔精神狀態(tài)等均較第1 天有所好轉(zhuǎn)。造模后第5 天細胞間隙減小，炎癥細胞開始減少，說明細胞水腫及炎癥反應開始減輕；成纖維細胞開始出現(xiàn)，其可與新生毛細血管共同形成肉芽組織，說明開始進入組織機化期，此時行為學觀察顯示實驗兔已恢復如常，與造模前基本相同。造模后第7 天肌纖維及瘢痕組織的形成典型的組織機化期表現(xiàn)，說明正式進入組織機化期。

本研究通過對骨骼肌急性損傷后實驗兔日常行為學及形態(tài)學觀察證明了急性骨骼肌損傷分期模型方法的可行性及可復制性。但本研究僅對實驗兔骨骼肌損傷急性期進行了短期的觀察，后續(xù)進一步長期的觀察可更加完整地體現(xiàn)整個骨骼肌損傷的修復過程。此外，本研究僅局限于對骨骼肌損傷后自然修復過程的觀察，若同時與采用不同手段進行干預相對比，研究將具有更加重要的意義。