27種叢枝菌根真菌接種對盆栽云木香生理生化及主要萜類成分的影響

陽文武 郭冬琴 曹緯國 潘興嬌 薛彥斌 張杰 周濃

摘 ?要：在室溫盆栽實驗條件下，研究了27種外源性叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌對云木香幼苗的根系菌根侵染率、生理生化特性、根生物量及萜類成分積累的影響。研究結(jié)果表明，云木香與AM真菌形成了良好的共生關(guān)系，但27種AM真菌菌株與云木香二者之間存在共生偏好性。與對照組（CK）相比，部分AM真菌提高云木香葉片中可溶性蛋白和可溶性糖含量及抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，增強云木香抗不利環(huán)境的能力;部分AM真菌處理組云木香根生物量顯著增加（P<0.05）;大部分AM真菌處理組云木香根中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯及總內(nèi)酯含量顯著增加（P<0.05），也有部分AM真菌處理組差異不明顯或降低。從綜合接種效應來看，易誤巨孢囊霉（Gigaspora decipiens，Gd）、美麗盾巨孢囊霉（Scutellospora calospora，Sca）、瑚狀盾巨囊霉（Racocetra coralloidea，Rco）、沙荒球囊霉（Septoglomus deserticola，Sde）、哥倫比亞內(nèi)養(yǎng)囊霉（Entrophospora colombiana，Ec）、巴西類球囊霉（Paraglomus brasilianum，Pb）等是人工栽培條件下接種AM真菌云木香幼苗的潛在優(yōu)良菌株，可為提高云木香產(chǎn)量和品質(zhì)開辟一條新的途徑。

關(guān)鍵詞：云木香;叢枝菌根真菌;接種效應;生理生化特性;萜類成分;共生偏好性

中圖分類號：R282.2 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： A pot experiment was conducted to investigate the effects of 27 exogenous arbuscular mycorrhizal （AM） fungi strains on the root mycorrhiza infection rate， physiological and biochemical characteristics， root biomass and terpenoids accumulation of Aucklandia lappa seedlings at room temperature. A. lappa had a good symbiotic relationship with AM fungi， but there was difference in the preference of 27 exogenous AM fungi species for A. lappa. Compared with CK， some AM fungi increased the soluble protein and soluble sugar content and antioxidant enzyme activity in the leaves of A. lappa， reduced the malondialdehyde content， enhanced the ability of A. lappa to resist adverse environment. Biomass of the roots of A. lappa increased significantly in some AM fungal treatment groups. In most AM fungi treatment groups， the content of costunolide， dehydrocostus lactone and total lactones in the roots of A. lappa increased significantly （P<0.05）， while some AM fungi treatment groups showed no significant difference or decrease. According to the comprehensive inoculation effect， Gigaspora decipiens， Scutellospora calospora， Racocetra coralloidea， Septoglomus deserticola， Entrophospora colombiana， Paraglomus brasilianum are the potential strains to inoculate A. lappa seedlings under artificial cultivation conditions， which could help to improve the yield and quality of A. lappa.

Keywords： Aucklandia lappa; arbuscular mycorrhizal fungi; inoculation effect; physiological and biochemical characteristics; terpenoids; symbiotic preference

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.015

云木香（Aucklandia lappa Decne.）為菊科云木香屬多年生草本植物，其干燥根是國內(nèi)外著名的傳統(tǒng)中藥材“木香”，具有行氣止痛、健脾消食等功效[1]。云木香在我國分布廣泛，主產(chǎn)于云南、重慶、四川、湖北等省市。在國內(nèi)，云木香種植面積最大在重慶市開州區(qū)[2-3]。萜類是云木香的主要有效成分，并以木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為代表，二者也是云木香藥材質(zhì)量控制的指標之一[1，4]。研究表明，萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、利膽、促胃動力、抗胃潰瘍、解痙鎮(zhèn)痛、抗菌等生物活性[4-5]。目前，隨著云木香道地藥材產(chǎn)地擴散而栽培面積不斷擴大，盡管在人工栽培技術(shù)方面取得了許多重要進展，但仍存在病蟲害嚴重、入藥品質(zhì)不穩(wěn)定等[2， 6]生產(chǎn)中迫切需要解決的問題。

菌根是自然界廣泛存在的植物共生現(xiàn)象。叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌是一類在生物防治土傳病害和提高植物抗/耐病性方面極具應用潛力的微生物資源[7-9]。以往的研究結(jié)果支持AM真菌能有效促進宿主植物對營養(yǎng)元素的吸收[10]，有助于改善藥用植物的生長發(fā)育[11]，增強宿主植物對根腐病等病蟲害的抗病性[12]，增加宿主植物的生物量和影響植物的次生代謝過程[13]。課題組前期研究表明，AM真菌對云木香的光合生理、次生代謝產(chǎn)物均有顯著影響[14-15]，但關(guān)于不同AM真菌菌株對云木香生理生化和次生代謝產(chǎn)物影響的研究未見報道。為此，本試驗采用可控實驗，模擬大田生產(chǎn)進行促生試驗，接種外源性27種AM真菌菌株，篩選出對云木香生長有益的優(yōu)勢AM真菌種類，探討其對云木香生長發(fā)育的促進作用和改善土壤生態(tài)的效果，對實現(xiàn)云木香產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ? 供試菌株與植物材料 ?（1）AM真菌菌株：微白巨孢囊霉（Gigaspora albida，Ga）、易誤巨孢囊霉（G. decipiens，Gd）、巨大巨孢囊霉（G. gigantea，Gg）、球狀巨孢囊霉（G. margarita，Gm）、玫瑰紅巨孢囊霉（G. rosea，Gr）、美麗盾巨孢囊霉（Scutellospora calospora，Sca）、雙紫盾巨孢囊霉（S. dipurpurascens，Sdi）、透明盾巨孢囊霉（S. pellucida，Spe）、異配盾孢囊霉（Dentiscutata heterogama，Dh）、瑚狀盾巨囊霉（Racocetra coralloidea，Rco）、亮色盾巨孢囊霉（R. fulgida，Rfu）、沙荒球囊霉（Septoglomus deserticola，Sde）、黏質(zhì)球囊霉（S. viscosum，Svi）、摩西球囊霉（Funneliformis mosseae，F(xiàn)m）、明球囊霉（Rhizophagus clarus，Rcl）、根內(nèi)球囊霉（R. intraradices，Rin）、孔窩無梗囊霉（Acaulospora foreata，Afo）、何氏無梗囊霉（A. koskei，Ako）、細凹無梗囊霉（A. scrobiculata，Asc）、刺無梗囊霉（A. spinosa，Asp）、象牙白多孢囊霉（Diversispora eburnea，De）、沾屑多孢囊霉（D. spurca，Ds）、哥倫比亞內(nèi)養(yǎng)囊霉（Entrophospora colombiana，Ec）、巴西類球囊霉（Paraglomus brasilianum，Pb）、隱類球囊霉（P. occultum，Po）、薄壁兩性囊霉（Ambispora leptoticha，Ale）、崔氏原囊霉（Archaeospora trappei，Atr），27株AM真菌均由國際叢枝菌根真菌菌種保藏中心（INVAM）提供，并經(jīng)重慶三峽學院生物與食品工程學院郭冬琴副教授進行鑒定，作為本實驗供試菌株。（2）木香種子：2012年10月22日，課題組在位于重慶市開縣河堰鎮(zhèn)的云木香種植基地，選取株高、株型一致的健壯植株，采其成熟、新鮮的種子，并經(jīng)重慶三峽學院周濃教授鑒定為菊科植物木香Aucklandia lappa Decne。

1.1.2 ?主要試劑 ?木香烴內(nèi)酯對照品（批號：110795-200806，含量99.0%）、去氫木香內(nèi)酯對照品（批號：110757-200206，含量98.0%），中國食品藥品檢定研究院;甲醇（色譜純），德國Merck公司;水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.1.3 ?儀器與設(shè)備 ?LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津;BX51型顯微鏡，日本Olympus;SZX2型解剖顯微鏡，日本Olympus;KH-2000DB超聲波清洗器（功率250 W，頻率50 kHz），昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;CP224S型萬分之一天平，德國賽多利斯公司;ED53干燥箱，德國Binder公司;圣德利SDLA-B-1101型超純水機，重慶圣德利醫(yī)療器械研究有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?接種處理及栽培管理 ?栽培用容器為15 cm×18 cm的棕色塑料花盆（用酒精擦拭3遍后用），栽培介質(zhì)為園土和河沙按3∶1體積比混合制成，并經(jīng)10目（2 mm）篩篩選，在121 ℃滅菌2 h。實驗地點為重慶市萬州區(qū)鐵峰山國家森林公園室內(nèi)，實驗時間為2013年2月至2014年12月。

試驗共設(shè)28個處理，設(shè)27組AM真菌處理組（育苗時單一接種AM真菌）和CK（對照）處理組（幼苗生長過程中不接種AM真菌），每處理組10個重復，每盆播種木香種子20粒，出苗后間苗5株。AM真菌接菌體均勻施于云木香種子（10%次氯酸鈉溶液消毒15 min）的表土下，接種劑量為每盆300個孢子（接菌體帶有孢子、菌絲及侵染后根系的栽培基質(zhì)），同時播種紫云英（10%次氯酸鈉溶液消毒15 min）混合培養(yǎng)，待云木香幼苗出土后除去紫云英植株。將盆栽放置于室溫（自然光照）內(nèi)，定期觀察與分析，按照云木香的常規(guī)養(yǎng)護方法管理，每周澆1次Hoagland營養(yǎng)液。

1.2.2 ?樣品采集與指標測定 ?（1）云木香葉片生理生化指標的測定。于2014年07月采集云木香幼苗葉片，利用張志良等[16]的方法檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量。

（2）云木香幼苗生物量的測定。于2014年12月份收獲云木香根、須根，須根在冰水浴中洗凈后剪成約1 cm長根段置于福爾馬林-醋酸-酒精（FAA）固定液中固定，備用;根洗凈后測定不同處理組新鮮生物量，于35 ℃烘箱中烘干至恒重，稱定重量，計算折干率，折干率（%）=[干燥至恒重根重量（g）/新鮮根重量（g）]×100%，備用。

（3）AM真菌的侵染率測定。隨機選取浸泡于FAA固定液中云木香須根50條，采用Philips等[17]的方法染色、制片、鏡檢，根據(jù)Trouvelot等[18]的方法統(tǒng)計菌根侵染率。

（4）木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量測定。按照2015年版《中華人民共和國藥典》[1]（一部）木香藥材【含量測定】項下的方法，檢測2種倍半萜內(nèi)酯化合物的含量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

每個指標重復測10次，結(jié)果以平均值±標準差表示。采用Excel 2003軟件計算平均值、標準差，運用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和顯著性檢驗，使用Excel 2003軟件繪圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同AM真菌處理下云木香幼苗根系侵染率

接種27種外源性AM真菌處理條件下，云木香幼苗的根系侵染率存在一定差異，與CK相比，均達顯著性差異（P<0.05）（圖1）。由圖1可以看出，未接種AM真菌的處理組（CK組）未觀察到明顯的菌絲和囊泡結(jié)構(gòu)，侵染率均為0，其中Ga、Gr、Sca、Rco、Sde、Svi、Rcl、Ds、Pb和Ale處理組的侵染率較高，均在70%以上，最低的Sdi處理組的菌根侵染率只有35.14%。27種AM真菌對云木香根系的侵染力不同，這說明AM真菌與云木香之間具有一定的偏好性。

2.2 ?不同AM真菌處理下云木香葉片抗氧化酶活性

為了研究AM真菌對宿主植物生理水平的影響，測定了云木香接種AM真菌后抗氧化酶系統(tǒng)（CAT、POD和SOD）的活性變化（圖2）。由圖2可看出，接種27種外源性AM真菌對云木香幼苗葉片中過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響不同，與CK相比，部分處理組差異顯著（P<0.05）。

具體來說，與CK組相比，不同AM真菌處理對云木香幼苗葉片CAT活性均有所增加，除Ga、Rcl、Atr處理組外，其余處理組均達顯著差異（P<0.05），其中活性最強的Gd處理組是CK組的5.9倍。同時，不同AM真菌處理對云木香幼苗葉片POD活性無明顯規(guī)律，其中Gr、Sca、Dh、Rfu、Ec和Pb處理組顯著增強了POD活性，并達顯著差異（P<0.05）;其余處理組POD活性均低于CK組，除Atr處理組外，均達顯著差異（P<0.05）;POD活性最高的Ec處理組是CK組的1.6倍，活性最低的Ako處理組僅為CK組的0.4。另外，除Gg、Gm、Gr、De、Po和Ale處理組外，其余AM真菌處理組SOD活性均有所增加，并達顯著差異（P<0.05）。其中，SOD活性最高的Rcl處理組是CK組的2.3倍，活性最低的Gm處理組僅為CK組的0.4?？傮w來看，Sca、Dh、Rfu、Ec和Pb處理組均顯著提高了CAT、POD、SOD活性。

2.3 ?不同AM真菌處理下云木香葉片丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白含量

由圖3可知，與CK組相比，除Gr和De處理組顯著增加、Pb和Po處理組顯著降低，并達不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

顯著性差異（P<0.05）外，其余AM真菌處理組對云木香幼苗葉片中丙二醛（MDA）含量增加或降低幅度不一致，未達到顯著性差異（P<0.05）。

同時，方差分析結(jié)果表明，接種不同AM真菌處理條件下，外源性AM真菌可調(diào)控（增減）云木香植株葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量。其中，Gr、Sca、De、Spe處理組葉片中可溶性糖含量顯著提高（P<0.05），Sca、De、Po和Ale處理組葉片中可溶性蛋白的含量顯著增加（P< 0.05）。

2.4 ?不同AM真菌處理下云木香根生物量和折干率

由表1可知，與CK組相比，Gd、Sca、Dh、Rco、Rfu、Sde、Afo、Asc、Asp、Ec和Atr等11個處理組提高了云木香根的鮮重和干重，其中Sca、Rco、Sde處理組達差異顯著（P<0.05）。此外，各AM真菌處理組云木香根折干率均不同程度地下降，其中Ga、Gd、Gg、Dh、Svi、Fm、Rcl、Ako、De、Pb、Po和Ale處理組顯著降低了云木香幼苗根折干率（P<0.05），表示云木香根的生物量增加是通過AM真菌促進其吸收水分所致，進而降低根的折干率。

2.5 ?不同AM真菌處理下云木香根中倍半萜內(nèi)酯類化合物含量

由表2可知，接種27種外源性AM真菌改變了云木香萜類化合物中2種主要組分的相對百分含量，均影響了云木香幼苗根中萜類化合物的代謝過程。與CK組相比，大部分AM真菌處理組云木香根中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量及總內(nèi)酯含量顯著增加（P<0.05），也有部分AM真菌處理組差異不明顯或降低。

除Ga、Ako和De處理組降低了云木香根中木香烴內(nèi)酯含量外，其余AM真菌處理組均提高了木香烴內(nèi)酯含量，部分達顯著性差異（P<0.05）;除Ga、Svi、Ako、De和Ale處理組降低了云木香根中去氫木香內(nèi)酯含量和總內(nèi)酯含量外，其余AM真菌處理組均提高了去氫木香內(nèi)酯含量和總內(nèi)酯含量，部分達顯著性差異（P<0.05）。整體來說，Gd、Sca、Rco、Sde、Rcl、Ec和Pb處理組總內(nèi)酯含量顯著增加，分別是CK組的4.57倍、4.75倍、4.78倍、5.32倍、4.53倍、4.28倍、5.51倍?？梢?，AM真菌的加入有利于人工栽培條件下云木香萜類化合物含量的提高。

2.6 ?不同AM真菌處理組下云木香幼苗根中木香內(nèi)酯產(chǎn)量

由圖4可以看出，與CK組相比，除Ga、Gr、De、Svi、Ako、Rin、Ale處理組外，其余AM真菌處理組提高了根中木香內(nèi)酯產(chǎn)量（單株幼苗根中所含總內(nèi)酯含量與其根產(chǎn)量的乘積），其中Gd、Sca、Dh、Sde、Afo、Asc、Asp、Rco、Rfu、Ec、Rcl、Pb和Atr處理組顯著提高了云木香根中木香內(nèi)酯產(chǎn)量（P<0.05）。這說明，大部分云木香根系叢枝菌根的形成有利于其根中木香內(nèi)酯產(chǎn)量的積累，屬于根中活性成分木香內(nèi)酯含量和根生物量綜合效應的增加。

3 ?討論

大量研究表明，AM真菌能與宿主植物根系形成互利共生的叢枝菌根，有利于宿主植物的初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物積累，但不同AM真菌對宿主植物作用效果也不同[19-21]。本研究結(jié)果顯示，不同的外源性AM真菌菌株均能侵染云木香幼苗根系從而形成共生關(guān)系，根系菌根侵染率能力因菌根真菌菌株不同而存在顯著差異，說明云木香與AM真菌二者間具有明顯的相互選擇性，這與張杰等[13]在滇重樓幼苗上的研究結(jié)論一致。然而，AM真菌對云木香幼苗侵染率偏低，可能與其根系的嚴重木質(zhì)化[22]、植物種類[23]、同一宿主植物的不同基因型品種[13]等差異有關(guān)。因此，人工接種外源性AM真菌對云木香的菌根生活力有差異，說明云木香與AM真菌良好匹配對于菌根化育苗的重要性。

AM真菌對宿主植物生理生化的影響是其生態(tài)效應的直接體現(xiàn)，而抗性酶活性、可溶性蛋白和可溶性糖含量等的變化可以間接反映宿主植物植株代謝功能的強弱[24]。本研究結(jié)果顯示，接種外源性AM真菌后，部分AM真菌處理組云木香幼苗葉片內(nèi)CAT活性、SOD活性和POD活性增強，可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，MDA含量降低，從而減緩云木香幼苗葉片的細胞膜脂過氧化程度，增強其細胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性，能有效增強自由基清除系統(tǒng)的活性，可提高云木香植株的抗性，這與潘興嬌等[14]、韋正鑫等[25]在云木香、滇重樓上得出的結(jié)論一致。因此，接種不同AM真菌處理后云木香幼苗在生理生化特性響應方面存在差異，亦是AM真菌菌株與云木香種質(zhì)優(yōu)良組合篩選的重要依據(jù)，表明接種AM真菌可培育具有較強生理活性和抗逆性的健壯云木香苗，具有廣泛的應用前景。

27種供試AM真菌菌株均能夠與云木香幼苗建立良好的共生關(guān)系，部分菌株能促進其生物量的增加和萜類化合物的積累。木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯等倍半萜內(nèi)酯是云木香萜類化合物的主要活性成分，常被作為云木香的品質(zhì)評價指標[1]。課題組前期已證實，接種外源性AM真菌能明顯促進云木香根生物量的積累和提高云木香根的品質(zhì)[15]，同時AM真菌種類對宿主植物次生代謝產(chǎn)物的影響不同[20]，本實驗結(jié)果也證明了這一點。與CK組相比，大部分AM真菌處理組云木香幼苗根中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯含量及總內(nèi)酯含量顯著增加（P<0.05），也有部分AM真菌處理組差異不明顯或降低，間接提高了云木香的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，在云木香的人工栽培實際應用中，可以考慮引入與云木香有共生偏好性的菌根真菌菌株，以期克服栽培過程中云木香的病蟲害問題，提高云木香的栽培效率和品質(zhì)、產(chǎn)量。

4 ?結(jié)論

綜上所述，本研究以云木香幼苗（實生苗）的菌根侵染率、生理生化、保護酶活性、生物量和倍半萜內(nèi)酯含量為綜合評價指標，確定其產(chǎn)量和品質(zhì)同步增長的易誤巨孢囊霉（Gigaspora decipiens，Gd）、美麗盾巨孢囊霉（Scutellospora calospora，Sca）、瑚狀盾巨囊霉（Racocetra coralloidea，Rco）、沙荒球囊霉（Septoglomus deserticola，Sde）、哥倫比亞內(nèi)養(yǎng)囊霉（Entrophospora colombiana，Ec）、巴西類球囊霉（Paraglomus brasilianum，Pb）等是人工栽培條件下接種AM真菌云木香幼苗的潛在優(yōu)良菌株。上述研究結(jié)果將為云木香菌根互作理論提供基礎(chǔ)資料，為AM真菌促進菊科藥用植物生長及其資源的可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

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